當前關于病原體宏基因組高通量測序產品的幾點考慮（原創2022-09-29CMDE中國器審）感染性疾病是由病原微生物（細菌、病毒、真菌、寄生蟲等）引起的疾病的統稱。據統計感染性疾病死因占全部死因的25%以上，是當今世界嚴重威脅人類健康的重大疾病。長期以來感染性疾病的診斷和療效監測一直依靠形態學、免疫學、分子生物學以及病原體分離培養等方法，這些方法各有優缺點，在感染性疾病的輔助診斷中發揮著重要作用。近年來新興的病原體宏基因組高通量測序（metagenomicnext-generationsequencing，mNGS）技術，是指采用高通量測序技術對特定臨床樣本中所有核酸進行測序，并通過生物信息學分析判斷樣本中是否存在病原體的檢測方法。與傳統基于分離培養的病原體檢測技術相比，該技術從理論上講能夠無偏倚的檢測各類微生物（如：病毒、細菌、真菌、寄生蟲等），包括難以培養的病原體以及新發病原體。mNGS技術是一個開放的分析和診斷系統，對于mNGS技術所檢測的病原體數量未有明確規定，根據不完全統計，開展相關檢測服務的機構已納入的病原體有近萬種，包括細菌、病毒、真菌和寄生蟲等，為疑難危重癥及罕見病原體感染的診斷提供了有效的技術手段。在特定的臨床應用場景下，具有臨床意義。針對mNGS的臨床應用，目前已有多個臨床專家共識。結合該技術的特點，我中心對相關產品的臨床應用、設計開發、驗證確認等方面進行了專題研究，現將當前的幾點考慮總結如下。一、關于產品預期臨床使用場景基于mNGS技術的產品與常規的病原體檢測產品相比，具有檢測過程較為復雜、易受到人源基因的干擾、檢測時間較長、結果解讀專業要求高、檢測成本高等特點，一般用于傳統檢驗方法未能給出明確病原學結果從而影響患者準確診療的感染性疾病、新發突發傳染病、危急重癥或排除其他發熱疾病。推薦臨床通過擬診先行傳統微生物檢驗及常規分子生物學產品檢測常見病原體，不盲目使用mNGS技術。在必要或緊急情況下，如危急重癥、群體性感染事件等，可考慮與常規方法同步進行檢測。對常規微生物學檢查容易明確的病原體不建議進行mNGS檢測。從臨床角度，mNGS結果不能單獨作為病原學確診或排除的證據。適用場景舉例如下：（一）患者表現為發熱或發熱癥候群，病因未明確（符合不明原因發熱定義），考慮感染或不除外感染，但規范性經驗抗感染治療無效，在應用常規技術檢測的基礎上，開展mNGS產品檢測。（二）各種原因導致患者急危重癥表現，不除外感染所致，或考慮繼發或并發危及生命的嚴重感染，在常規檢測的基礎上，開展mNGS產品檢測。（三）免疫受損患者疑似繼發感染，常規病原學檢查未能明確致病原或/和規范性經驗抗感染治療無效，建議進一步完善常規病原學檢測的同時，或在其基礎上，開展mNGS產品檢測。（四）疑似局部感染，病原學診斷未明確、不及時處理則后果嚴重時，在常規檢測的基礎上，開展mNGS產品檢測。（五）高度疑似感染性疾病，但病原學診斷未明確且常規抗感染治療無效，建議進一步完善常規病原學檢測、處理原發感染灶，調整經驗抗微生物治療方案的同時開展mNGS檢測。（六）慢性感染，或慢性疾病不除外感染，尤其是二者臨床表現相似、難以鑒別時，病情嚴重或抗感染治療療效不佳需要明確病因，建議在完善常規檢測、調整經驗治療的同時開展mNGS產品檢測。（七）其他患者疑似特殊病原體感染或從相關流行病學角度考慮需要進行mNGS產品檢測。二、關于產品的檢測樣本及適應證mNGS產品在目前的臨床應用研究中涉及多種適應證，如：中樞神經系統感染、血流感染、局灶性感染、呼吸道感染、感染性腹瀉等,對于具有相關臨床癥狀的病例，應在按照現有診療流程進行標準化診療的基礎上開展檢測。針對患者感染部位不同，采集的樣本類型也不同，產品適用的樣本類型主要包括：靜脈血、腦脊液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔積液、腹水、組織、局灶穿刺物、糞便等多種類型。對于樣本的采集，應注意以下兩個方面，一是，對于無菌體液，如靜脈血、腦脊液、胸腔積液、腹水等，需按照嚴格的無菌操作采集樣本，采集的樣本須置于無菌容器內；二是，對于有菌部位的樣本，如痰液、肺泡灌洗液、咽拭子等，應標明樣本的采集部位，在樣本采集過程中應盡量避免引入該部位的正常菌群，以免干擾后續檢測結果。采集的樣本應盡量選取感染部位的體液或組織，可提高檢測結果的可信度。若感染部位的樣本采集難度較大，可選擇外周血液樣本，但有可能會降低檢測結果的準確性。產品適用的樣本類型推薦優先選擇無菌采集的樣本。關于不同適應證適用的樣本類型舉例見表1。表1.產品適應證與適用的樣本類型舉例三、關于產品檢測病原體種類范圍mNGS產品檢測原理為對臨床樣本中存在的病原體核酸進行無偏倚的檢測，從產品檢測的技術角度考慮，除新發病原體外，產品的檢測范圍不應局限為某一種或某幾種常見病原微生物，應為產品適應證、適用樣本中所有可報告的病原微生物。產品所檢測的病原微生物受幾個方面的影響，一是產品配套使用的參考數據庫及生信分析過程涵蓋的病原體種類，如數據庫中未涵蓋某種病原體基因組參考序列，則該類病原體不在該產品的檢測范圍之內；二是檢測樣本類型、核酸提取等會直接影響產品病原體的檢測種類，不同的樣本類型可能檢出的病原體會存在差別，如腦脊液樣本檢出的病原體主要以中樞神經系統感染的病原體為主，而糞便樣本檢出病原體主要為消化系統感染的病原體。不同的核酸提取方式對病原體的檢出種類也會產生影響，如核酸提取過程未考慮破壁，則產品可能不適用于具有厚細胞壁的病原體檢測；三是產品檢測的目標物是否包括不同類型的核酸靶標，如產品檢測的靶標僅為DNA，則RNA病毒不在該產品的檢測范圍之內。相關產品的申請人應依據產品設計、適用的樣本類型、適應證等多個方面綜合考慮產品預期用途，確定合理的病原體檢測范圍。四、關于產品配套使用的數據庫mNGS產品檢測結果，除了產生可用于比對的微生物短片段序列外，還存在大量人源、環境微生物、試劑含有的微生物等背景核酸序列，必須依靠生物信息學手段對其進行篩選、過濾、比對，最終給出微生物物種注釋。結果分析過程中，數據庫的使用是必需的，而且是影響mNGS產品檢測結果準確性的重要因素。目前相關產品在選擇配套使用的數據庫時，一般會存在兩種情況，一種為直接選擇公共數據庫，如：NCBInr/ntdatabase、NCBIRefSeqdatabase等；另一種為自建數據庫，對公開數據庫中基因組序列進行挑選、整理、分類，然后通過程序軟件將收集到的基因組序列整理成適用于本產品的微生物及人源序列比對數據庫。針對成熟的產品，建議根據產品特點及臨床需要，使用臨床應用級的自建數據庫。在數據庫的構建、使用和管理方面應注意以下問題：（一）需要考慮數據庫的全面性以及納入物種在分類學上的代表性，對于同一種微生物，往往存在具有遺傳差異的不同亞型或株，所以在選擇基因組時，應考慮到微生物的遺傳多樣性，盡可能選取具有高度代表性的不同亞型或株的高質量基因組。（二）無論所選擇的參考基因組的來源如何，申請人需要考慮其注釋的準確性及序列的完整性，防止注釋錯誤、命名錯誤或者代表性不足臨床相關微生物列入庫。（三）申請人應在有必要的基礎上，對納入庫中的微生物的潛在的臨床意義進行注釋，讓結果解讀人員對檢測的微生物有基本的認識和判斷。（四）由于病原體在自然狀態下是不斷發生進化變異的，致病性也是動態變化的，所以需要及時（或定期）對參考數據庫中的基因組信息及臨床致病證據進行更新。（五）當數據庫發生可能影響病原體判讀結果的更新后，應對更新后的數據庫進行驗證與確認。（六）應構建全面的人源基因序列數據庫，并評估最新版國際人類參考基因組和用于構建人源基因序列數據庫所選擇的參考基因組差異，進而評價人源基因序列數據庫的代表性，人源基因序列數據庫用于在生信分析過程中過濾人源基因數據。（七）mNGS檢測產品檢測過程中一些樣本中會存在背景菌序列、環境微生物及實驗室殘留微生物，這些基因序列可造成測序污染，導致假陽性結果產生；另外，一些樣本（例如呼吸道樣本）會存在定植微生物，因此，針對產品需要構建檢測背景庫用于過濾污染序列、區分背景病原體和致病性病原體。五、關于測序數據要求人體不同的樣本類型單位體積含有的細胞數量有巨大的差異，最終的測序數據由微生物序列和人源基因組序列組成，不同的人源細胞含量、病原微生物感染的類型和病原體含量的高低都會影響測序數據中目標微生物序列占比，如組織樣本的人源細胞含量比較高，測序所得的序列數據中相應微生物的占比可能較少，因此，mNGS產品在不同的樣本類型中，產品分析靈敏度會存在差異。該類產品可通過增加測序數據量來提高待檢出的微生物數據量，或通過富集微生物含量以提升微生物序列的占比，從而提高微生物的檢出率。一般而言，在一定范圍內隨著測序數據量的增加，產品的靈敏度會有所提升。因此，為了保證產品具有滿足臨床要求的靈敏度，針對某一樣本類型，應保證一定的測序數據量。產品在設計上，一般分為去除宿主人源基因與未去除宿主人源基因兩種設計，去除宿主人源基因后，產品產生的相應數據量會大大減少。在缺乏有效的人源宿主去除步驟的情況下，單個樣本檢測所需的數據量應充分評估并設立合理的指標要求。測序模式一般為單端測序和雙端測序，雙端測序所花費的經濟成本及時間均高于單端測序，如產品設計選擇單端測序，為確保序列比對的準確性，避免因同源錯配導致的序列比對錯誤，可參考相關專家共識的要求，如測序序列單端讀長當前建議不少于50bp。為了保證數據分析的可靠性，產品檢測的下機數據應有一定的質量要求。下機數據經拆分后即得到每個樣本的測序數據，需要進行數據質量過濾，包括過濾測序接頭、低質量序列、低復雜度序列、重復序列等，將獲得的高質量讀長序列作為微生物鑒定的輸入數據。一般而言，數據應達到以下指標：Q30堿基數量占比>80%、接頭污染比例不超過1%、有效序列長度不小于50bp、數據的有效比對率應大于70%等。六、關于產品陽性判斷值的研究產品陽性判斷值的研究，主要是為了區分真陽性、真陰性，以及判斷實驗過程中污染的微生物等。基于mNGS技術的產品，陽性判斷值應包含度量標準，例如檢測結果中能夠比對到數據庫中的微生物的序列數、對某種微生物的基因組覆蓋度等，可通過ROC曲線分析的方法對產品的陽性判斷值進行研究。在陽性判斷值研究過程中應注意，胞內菌和厚壁微生物檢出率低，因此即使在檢測報告中某種/某些胞內菌/厚壁菌檢出序列數不高，也要考慮其為致病病原體的可能。七、關于產品檢測結果的報告用于臨床輔助診斷的mNGS報告應包括測序總序列數、檢測病原微生物列表、檢出病原特異序列數量、檢測病原范圍、覆蓋度、測序深度、檢測方法及檢測技術說明。需要注意的是，檢測結果僅代表臨床樣本中檢出或未檢出某微生物的核酸片段，不能明確該物種與感染的關系，即使陰性結果也需結合臨床表現及其他檢查結果進行綜合判斷。對于胞內菌和厚壁微生物的檢測，因技術原因存在一定的偏倚，如對于胞內感染菌因釋放到體液中含量較少而導致檢測敏感性偏低，對具有較厚細胞壁的病原微生物如真菌感染，可能由于核酸提取效率較低，相對檢出率低，導致臨床檢出率和敏感性較低。因此即使在檢測結果中某種胞內菌/厚壁菌檢出序列數不高，也要考慮其為致病病原體的可能。mNGS信息量大，臨床應用過程中，檢驗機構依據檢測結果出具檢驗報告時，有些情況下不可能在結果中列舉出所有檢測到的病原體，對于罕見病原體、胞內菌等，可能因檢出序列數少、微生物豐度低，在報告中未能列舉，如果臨床有疑似特殊病原體的感染，應該可以追溯原始數據庫進行查詢。八、關于產品驗證與確認的考慮基于mNGS技術的產品，因其預期用途涵蓋的病原體的種類非常廣，產品驗證與臨床試驗應對檢測范圍內的病原體進行有充分覆蓋度、有充分代表性的性能評價。產品臨床試驗在入組人群上，應與產品臨床適用人群一致。在對比方法選擇上，應選擇臨床參考方法作為對比方法，臨床參考方法應綜合病原體分離培養、患者的影像學檢查結果、基于宿主反應的檢測結果等。同時，由mNGS獲得致病病原體后，臨床上會針對病原體進行精準治療，治療后患者的臨床表現和治療效果的隨訪結果也可以作為臨床試驗對比方法的證據。臨床試驗過程中，應關注試驗體外診斷試劑對一些對于胞內感染菌、具有較厚細胞壁的病原微生物等的臨床性能研究。

參考文獻：1.宏基因組分析和診斷技術在急危重癥感染應用的專家共識[J].中華急診醫學雜志,2019(02):151-155.2.宏基因組學測序技術在中重癥感染中的臨床應用專家共識(第一版)[J].中華危重病急救醫學,2020,32(05):531-536.3.《中華傳染病雜志》編輯委員會.中國宏基因組學第二代測序技術檢測感染病原體的臨床應用專家共識[J].中華傳染病雜志,2020,38(11):681-689.4.中華醫學會檢驗醫學分會.高通量宏基因組測序技術檢測病原微生物的臨床應用規范化專家共識[J].中華檢驗醫學雜志,2020,43(12):1181-1195.5.宏基因組高通量測序技術應用于感染性疾病病原檢測中國專家共識[J].中華檢驗醫學雜志,2021,44(02):107-120.6.中華醫學會檢驗醫學分會.宏基因組測序病原微生物檢測生物信息學分析規范化管理專家共識[J].中華檢驗醫學雜志,2021