第33課基因工程和生物技術的安全與倫理第十單元生物技術與工程學業質量水平：1．結合生活或生產實例，舉例說出基因工程的基本原理。結合生活或生產實例，舉例說出日常生活中的轉基因產品。(生命觀念)2．運用比較、歸納與概括的方法，理解限制酶和DNA連接酶的作用特點；運用結構與功能觀，理解載體的結構特點及作用。運用批判性思維，對轉基因技術在應用過程中帶來的影響，表明自己的觀點并展開討論。(生命觀念、科學思維)3．按照實驗操作步驟，進行DNA的粗提取與鑒定實驗，寫出實驗報告并與他人進行必要的交流。(科學思維、科學探究)4．運用演繹與推理、模型與建模，理解基因工程基本操作程序，進行簡單的設計。(生命觀念、科學思維)5．按照實驗操作步驟，利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗。(科學思維、科學探究)6．結合生活或生產實例，舉例說出基因工程的應用和蛋白質工程的基本原理，嘗試提出初步的蛋白質工程學構想，進行簡單的設計。(生命觀念、科學思維)7．運用批判性思維分析生殖性克隆人面臨的倫理問題和歷史上生物武器對人類造成的嚴重的威脅與傷害。討論并對我國不接受任何生殖性克隆人實驗和我國反對生物武器及其技術和設備的擴散做出理性解釋，培養正確的人生態度和價值觀。(社會責任)課標要點一重組DNA技術的基本工具主干梳理1．基因工程分子基因重組構建重組DNA分子表達產物2．重組DNA技術的基本工具細菌核苷酸磷酸二酯鍵黏性動、植物病毒噬菌體復制起點限制酶的識別序列標記外源DNA3．活動：DNA的粗提取和鑒定(1)活動原理①幼嫩的植物材料如果經過________后再研磨，細胞結構容易被破壞。②用____________________(SDS)處理材料，能使核蛋白________并與___________分離。③乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)能抑制_____________活性，防止核DNA被酶解。④DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度______，且Na＋與DNA形成鈉鹽。冷凍十二烷基硫酸鈉變性DNADNA酶高⑤DNA鈉鹽不溶于________而某些蛋白質能溶于________。⑥在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會被染成________。(2)活動步驟酒精酒精藍色研磨過濾離心管離心配對加冷酒精白色絮狀物◆自我診斷◆判斷正誤(正確的打“√”，錯誤的打“×”)1．切割質粒的限制性內切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列。(

)2．載體質粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標記基因。(

)3．DNA連接酶能將兩堿基間通過氫鍵連接起來。(

)4．當作載體的質粒DNA分子上至少含一個限制酶切割位點。(

)5．限制性內切核酸酶、DNA連接酶和質粒是基因工程中常用的三種×××√工具酶。(

)6．E.coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端。(

)7．可用豬血代替香蕉作為DNA粗提取和鑒定的實驗材料。(

)8．在DNA溶液中加入二苯胺試劑，沸水浴加熱，檢測結果呈藍色。(

)×××√◆精準答題◆如圖所示，四種質粒含有E1和E2兩種限制酶的識別位點，ampr表示氨芐青霉素抗性基因，tetr表示四環素抗性基因。(1)將兩端用E1切開的tetr基因與用E1切開的質粒X——1混合連接，連接后獲得的質粒類型有_____________(填字母，多選)。A．X——1

B．X——2C．X——3D．X——4A、B、C(2)若將上圖所示X——1、X——2、X——3、X——4四種質粒導入大腸桿菌(敏感型)，然后分別涂布在含有氨芐青霉素或四環素的兩種培養基上。在這兩種培養基上均不能生長的大腸桿菌細胞類型有_______________、___________________。(3)如果X——1用E1酶切，產生850對堿基和3550對堿基兩種片段，那么質粒X——2(tetr基因的長度為1200對堿基)用E2酶切后的片段長度為_____________對堿基。(4)若將外源的tetr基因兩端用E2切開，再與用E2切開的X——1混合連接，無質粒細胞含X——3的細胞4750并導入大腸桿菌細胞，結果顯示，含X——4的細胞數與含X——1的細胞數之比為1∶3，增大DNA連接酶用量能否提高上述比值？________。原因是____________________________________________________。【解析】(1)因目的基因和質粒都是用E1切開且X——1質粒上有兩個E1酶切位點，故ampr基因和tetr基因的黏性末端相同，既可能出現ampr基因和X——1連接的產物(X——1)，也可能出現tetr基因和X——1連接的產物(X——2)，還可能出現X——1兩端連接形成的產物(X——3)。(2)X——1含有ampr基因，該基因表達后對氨芐青霉素有抗性，X——2含有tetr基因，該基因表達后對四環素有抗性，X——3不含抗性基因，不能DNA連接酶對DNA片段沒有選擇性(或DNA末端相同)X——4同時含有ampr和tetr基因，ampr和tetr基因表達后，對氨芐青霉素、四環素都有抗性。因此在含有氨芐青霉素或四環素的兩種培養基上均不能生長的大腸桿菌中不含X——1、X——2、X——4，即無質粒細胞和含X——3的細胞。(3)若用E1酶切X——1，產生850對堿基的含ampr基因大部分的堿基片段和3550對堿基的含有E2酶切位點的片段，含3550對堿基的片段與tetr基因形成含有4750個堿基對的X——2質粒。用E2酶切割質粒，由環狀變為鏈狀，堿基對數不變。(4)含X——4的細胞數與含X——1的細胞數的比值與這兩種質粒的數量有關，這兩種質粒的形成是通過末端隨機結合形成堿基對，再由DNA連接酶連接缺口，而DNA連接酶對該DNA片段無選擇作用，故增加DNA連接酶的用量，不改變題中的比值。命題探究命題探究一基因工程的工具分析

1．有關限制性內切核酸酶的易錯點(1)限制性內切核酸酶是一類酶而不是一種酶。(2)限制性內切核酸酶作用于磷酸二酯鍵，而不是氫鍵。(3)不同種類的限制性內切核酸酶識別的序列與切割的位點不同，這體現了酶的專一性特點。(4)在切割含目的基因的DNA分子時，需在目的基因的兩端都用限制性內切核酸酶切割，使目的基因的兩端都有可連接的末端。(5)限制性內切核酸酶的識別序列一般由6個核苷酸組成，少數由4個、8個或其他數量的核苷酸組成。(6)兩個末端若是由同一種限制性內切核酸酶切割產生的，則兩片段連接后還具有該種限制性內切核酸酶的識別序列和切割位點。2．限制酶的選擇方法(1)根據目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。②不能選擇切點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。③為避免目的基因和質粒的自身環化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的切點)。(2)根據質粒的特點確定限制酶的種類①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致，以確保產生相同的黏性末端或平末端。②質粒作為載體必須具備標記基因等，所以選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中限制酶Sma

Ⅰ會破壞標記基因。3．與DNA有關的四種酶的比較項目限制酶DNA連接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脫氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵堿基對間的氫鍵作用結果形成黏性末端或平末端形成重組DNA分子形成新的DNA分子形成單鏈DNA分子4.載體上標記基因的作用載體上的標記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉入的受體細胞沒有抵抗相關抗生素的能力。當含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內表達，使受體細胞能夠抵抗相應抗生素，所以在受體細胞的培養體系中加入該種抗生素就可以只保留轉入載體的受體細胞，作用機理如圖所示：例1[2023·全國卷真題]某同學擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應限制酶的識別序列和切割位點)和質粒進行切割、連接，以構建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。下列重組表達載體構建方案合理且效率最高的是(

)A．質粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接【解析】酶3切割后得到的是平末端，應該用T4DNA連接酶連接，A不符合題意；質粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能連接，B不符合題意；質粒和目的基因都用酶1和C酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質粒上的連接方向，此重組表達載體的構建方案最合理且高效，C符合題意；若用酶2和酶4切割質粒和目的基因，會破壞質粒上的抗生素抗性基因，連接形成的重組表達載體缺少標記基因，無法進行后續的篩選，D不符合題意。即時鞏固某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入ampr或tetr中會導致相應的基因失活(ampr表示氨芐青霉素抗性基因，tetr表示四環素抗性基因)。有人將此質粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌。結果大腸桿菌有的被轉化，有的未被轉化，被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌。回答下列問題。(1)質粒載體作為基因工程的工具，應具備的基本條件有____________________________________________________________(答出兩點)，而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。(2)如果用含有氨芐青霉素的培養基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含環狀目的基因的細胞是不能區分的，其原因是___________________________________________________________；并且________________和含有復制起點、具有標記基因、含有一種或多種限制酶識別序列兩者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養基上均不能生長含有質粒載體_________________________________________________的細胞也是不能區分的，其原因是______________________________________________________。在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有____________的固體培養基。

【解析】(1)質粒能作為基因工程的載體的條件是質粒含有復制起點、具有標記基因、含有一種或多種限制酶識別序列等。(2)用含有氨芐青霉素的培養基對未被轉化的大腸桿菌和被轉化的三種大腸桿菌進行篩選時，未被轉化的大腸桿菌和僅含環狀目的基因的大腸桿含有插入了目的基因的重組質粒(或含有重組質粒)兩者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養基上均能生長四環素菌均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養基上均不能生長，故兩者無法區分；含有質粒載體的大腸桿菌和含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養基上均能生長，故兩者也無法區分，但前者細胞內還含有四環素抗性基因，而后者細胞內含有的重組質粒在插入目的基因時四環素抗性基因被破壞，因此在含有四環素的固體培養基上前者能生長，后者不能生長。命題探究二DNA的粗提取和鑒定分析

1．DNA與蛋白質在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同項目溶解規律2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液DNA溶解析出蛋白質NaCl溶液物質的量濃度從2mol/L逐漸降低的過程中，蛋白質溶解度逐漸增大部分發生鹽析沉淀溶解2.DNA的粗提取與鑒定實驗的細節分析實驗材料的選取凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但是使用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。哺乳動物的成熟紅細胞沒有細胞核，不能作為實驗材料不同實驗材料的處理方式若實驗材料是植物細胞，加入一定的研磨液，進行充分的攪拌和研磨，過濾后收集濾液；若實驗材料是動物細胞(如雞血細胞)，在其中加入一定量的蒸餾水，同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可SDS和EDTA在防止DNA降解中的作用SDS是蛋白質變性劑，能使核蛋白變性并與DNA分離；EDTA是離子螯合劑，能結合DNA酶的激活劑——鎂離子，能抑制DNA酶的活性提取和分離DNA用塑料離心管的原因細胞破碎后釋放出的DNA容易被玻璃容器吸附；由于細胞內DNA的含量本來就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會更少選擇玻璃棒且攪拌緩慢的原因玻璃棒有吸附DNA的作用，濃縮后的DNA絲狀物可以用緩緩攪動玻璃棒的方法卷起；玻璃棒攪拌速度過快，會導致DNA斷裂，無法獲得完整DNA例2下列關于DNA粗提取與鑒定的敘述，錯誤的是(

)A．用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近B．DNA析出過程中，攪拌操作要輕柔，以防DNA斷裂C．預冷的酒精可用來進一步純化粗提的DNAD．用二苯胺試劑鑒定DNA時需要進行水浴加熱A【解析】哺乳動物(如兔)成熟的紅細胞無細胞核，細胞內基本不含DNA，故用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量不相近，A錯誤；DNA析出過程中，攪拌操作要輕柔，以防止DNA斷裂，B正確；DNA不溶于冷酒精，向DNA提取液中加入適量預冷的酒精溶液，會使DNA析出，從而進一步提純DNA，C正確；向溶有DNA的溶液中加入二苯胺試劑，沸水浴加熱10min，溶液出現藍色，D正確。即時鞏固[2024·金華一中模擬]從目標生物提取分離DNA，是基因工程操作的基礎。下列關于“DNA粗提取和鑒定”實驗的敘述，錯誤的是(

)A．95%的冷酒精能除去蛋白質形成含雜質較少的DNAB．沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑，顏色呈藍色C．香蕉、新鮮豬血、菜花等動植物材料均可用于DNA的粗提取D．EDTA能抑制DNA酶活性，防止核DNA被酶解C【解析】DNA粗提取中，使用95%的冷酒精使DNA析出的原理是DNA不溶于95%的冷酒精，因此能除去蛋白質形成含雜質較少的DNA，A正確；沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑變藍，B正確；哺乳動物成熟的紅細胞沒有細胞核，所以豬血不能用于DNA的粗提取，而香蕉、菜花等植物材料可以用于DNA的粗提取，C錯誤；DNA酶可以水解DNA，EDTA能抑制DNA酶活性，防止核DNA被酶解，D正確。課標要點二基因工程的基本操作程序與DNA片段的擴增及電泳鑒定主干梳理1．基因工程的基本操作程序獲取______________、構建__________________、將重組DNA分子導入______________、檢測目的基因及其____________等步驟。目的基因重組DNA分子受體細胞表達產物2．原核細胞基因與真核細胞基因結構的異同項目編碼蛋白質的核苷酸序列啟動子終止子外顯子內含子原核細胞連續的有。位于基因的“上游”，有_____________結合的位點，控制_____的開始

有。位于_________，當RNA聚

合

酶到達時，釋

放

出RNA產物，轉錄結束無______真核細胞不連續的有。編碼蛋白質的序列有。不能編碼蛋白質的序列RNA聚合酶轉錄基因末端無3.獲取目的基因的方法(1)_______________(已知序列)：將核苷酸按照特定順序一個一個地連接起來。此方法成本較高，適于合成序列________的基因。(2)借助載體建立_____________①基因組文庫：把某種生物的基因組DNA切成適當大小，分別與________組合，導入微生物細胞，形成克隆，基因組中所有DNA序列克隆的總匯被稱為基因組文庫。②構建cDNA文庫的方法：從特定的組織或細胞中提取并純化全部化學合成法較短基因文庫載體__________，然后在____________等酶的催化下，以mRNA為模板合成互補的DNA，即cDNA。最后，借助載體，利用與構建基因組文庫相同的方法構建cDNA文庫。(3)聚合酶鏈式反應技術(__________技術)①特點：簡便、________、靈敏。②應用：醫學診斷、法醫鑒定、古生物學研究等方面。③模板：_____________________。④原料：4種___________________，即dNTP，N代表A、T、G、C四種mRNA逆轉錄酶PCR快速待擴增的DNA分子脫氧核苷三磷酸堿基。⑤酶：__________________________。⑥引物：兩段很短的單鏈DNA，分別可以與兩條______________復制起始端互補配對成小段雙鏈。⑦過程：包括多次________，每個循環分為3個步驟。變性：模板DNA雙鏈在高溫下(90～95℃)________斷裂，解旋成2條DNA單鏈

↓耐高溫的TaqDNA聚合酶DNA模板鏈循環氫鍵________：溫度降低(50～60℃)后，2個引物分別與各自互補的________________結合

↓延伸：分別以兩條DNA單鏈為模板，4種脫氧核苷三磷酸為原料，耐高溫的_________________酶在適宜的溫度(約72℃)下，以________與模板形成的小段DNA雙鏈區為起點，催化合成一條新的DNA互補鏈退火DNA單鏈TaqDNA聚合引物4．利用表達載體構建重組DNA分子(1)____________：用于大量擴增外源DNA的載體。(2)____________：使目的基因既能擴增又能表達出相應蛋白質的載體。表達載體包含適當的________和________信號。(3)用________限制性內切核酸酶剪切含有目的基因的DNA片段以及____________，然后用______________將它們連接起來，可完成體外重組，形成重組的DNA分子。(4)基因表達載體的組成克隆載體表達載體轉錄翻譯同種表達載體DNA連接酶上游RNA聚合酶轉錄目的基因末端標記基因5．將重組DNA分子導入受體細胞(1)________________：接受目的基因的細胞。(2)根據受體細胞類型可選擇不同的基因導入方法種類微生物細胞動物細胞植物細胞常用方法Ca2＋處理法______________農桿菌轉化法受體細胞原核細胞受精卵_____________轉化過程Ca2＋處理細胞→___________細胞→________________與感受態細胞混合→感受態細胞吸收DNA分子目的基因表達載體提純→取卵(受精卵)→_____________→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物目的基因插入___________的T——DNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞DNA中→表達受體細胞顯微注射法體細胞感受態重組DNA分子顯微注射Ti質粒6.檢測目的基因及其表達產物(1)借助載體上的____________可以檢測____________是否在受體細胞中穩定地存在并遺傳。(2)利用PCR技術檢測①根據目的基因的序列設計PCR________，利用待檢DNA為模板進行PCR；②通過________或DNA測序技術鑒定PCR產物。(3)利用核酸分子雜交技術檢測標記基因目的基因引物電泳①用化學方法使待檢的DNA變性成________并固定在________________上；②加入________，在適當的條件下探針與________的目的基因片段形成雙鏈；③漂洗硝酸纖維素膜去除________結合的探針后，若硝酸纖維素膜仍具有____________或熒光，則可判斷待檢DNA中含有目的基因；④運用核酸分子雜交技術還可檢測受體細胞中是否含有目的基因轉錄出的____________。單鏈硝酸纖維素膜探針互補放射性mRNA未互補(4)___________________技術：以目的基因表達出的__________為抗原，制備能與其特異性結合的并能被放射性或熒光標記的________。如果能探測到目的蛋白，則說明目的基因在受體細胞內成功表達。(5)觀察測定個體是否表現出目的基因控制的特定________并穩定遺傳，是判斷轉基因成功的直接證據。抗原——抗體雜交蛋白質抗體性狀7．活動：PCR擴增DNA片段及凝膠電泳鑒定(1)實驗原理①使用PCR技術擴增酵母細胞中編碼核糖體RNA的DNA部分片段，再通過___________________進行鑒定。②使用___________對凝膠進行染色，再用____________以及__________脫色，觀察并分析瓊脂糖凝膠中DNA條帶。瓊脂糖凝膠電泳亞甲基藍75%酒精蒸餾水(2)實驗步驟微量移液器微量離心管底部PCR儀-20電泳緩沖液0.1%亞甲基藍75%酒精蒸餾水45透明玻璃板加樣孔位置長度◆自我診斷◆判斷正誤(正確的打“√”，錯誤的打“×”)1．外源DNA必須位于重組質粒的啟動子和終止子之間才能進行復制。(

)2．檢測目的基因是否導入受體細胞可用抗原——抗體雜交技術。(

)3．表達載體的復制和胰島素基因的表達均啟動于復制起點。(

)4．應用DNA探針技術，可以檢測轉基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表達。(

)××××5．PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭等在使用前必須進行高壓蒸汽滅菌。(

)6．瓊脂糖凝膠電泳法可用于PCR產物的檢測。(

)7．轉基因抗蟲棉植株抗蟲效果的鑒定必須通過分子檢測。(

)√√×◆精準答題◆草甘膦是一種非選擇性除草劑，殺死雜草的同時也殺死農作物。它與植物體內的PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)結構相似，可與PEP競爭結合EPSP合酶，阻止PEP轉化，影響植物細胞正常代謝。我國科學家從草甘膦施用土壤中的某微生物體內獲取GR79基因(草甘膦抗性基因)，并將其導入植物體細胞中獲得抗草甘膦的轉基因植物。據圖回答下列問題。(1)GR79基因發揮抗草甘膦作用的機理可能是_______________________________________________________________。從分離得到的某土壤微生物體內獲取含有GR79基因的質粒，并將其保存在某細菌群體(受體菌)中，各個受體菌分別含有該微生物的不同的基因，這些受體菌群中該微生物的所有DNA序列克隆的總匯，稱為________________________。(2)據圖推測，利用PCR技術擴增GR79基因時，需設計能與該基因兩條模板鏈3′端_________________的引物；同時為構建該基因表達載體，需在引物1和引物2的_____端加上限制酶_________________的識別序列。GR79基因表達的產物阻止(或抑制)草甘膦與PEP競爭結合EPSP合酶基因文庫(或基因組文庫)堿基互補配對5′PstⅠ和XhoⅠ(3)實驗中常采用_______________法將GR79基因表達載體導入植物受體細胞。為避免該基因在近緣農作物中傳播，可將其導入植物受體細胞的___________________________________________________________________。除溫度、酸堿度等環境因素外，影響該基因導入植物受體細胞成功率的因素有__________________________________________________。(4)為檢測GR79基因是否導入植物體細胞，可在培養基中添加____________篩選含該基因的受體細胞；也可利用_______________________________________技術更加精準地進行檢測。農桿菌轉化

細胞質DNA上(或葉綠體DNA或線粒體DNA或葉綠體和線粒體DNA上)農桿菌的種類和活性、受體細胞的基因型和活性等草甘膦核酸分子雜交(或PCR和核酸分子雜交)若待檢DNA中含有該基因，則會發現硝酸纖維素膜上會出現_______________________。(5)經檢測，科研人員發現部分獲得GR79基因的植物幼苗不具有抗草甘膦的能力，原因可能是______________________________________________。【解析】(1)草甘膦與植物體內的PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)結構相似，會與PEP競爭結合EPSP合酶，影響細胞正常代謝，由此推測，GR79基因表達的產物能阻止(或抑制)草甘膦與PEP競爭結合EPSP合酶，從而發揮放射性或熒光條帶GR79基因轉錄或翻譯異常(或GR79基因表達異常)抗草甘膦作用。基因文庫能夠儲存一種生物的全部或者部分基因。(2)據圖推測，利用PCR技術擴增GR79基因時，需設計能與該基因兩條模板鏈3′端堿基互補配對的引物。由題圖可知，擴增目的基因時，應在引物的5′端添加相應的限制酶識別序列。由題圖中質粒結構可知，限制酶BamHⅠ的識別序列位于標記基因中，不能選用，且為防止目的基因自身環化和反向插入，應選擇兩種不同的限制酶，即PstⅠ和XhoⅠ，將它們的識別序列分別加在引物1和引物2的5′端。(3)實驗中常采用農桿菌轉化法將GR79基因表達載體導入植物受體細胞。為避免該基因在近緣農作物中傳播，可將其導入植物受體細胞的細胞質DNA上(或葉綠體DNA或線粒體DNA或葉綠體和線粒體DNA上)。除溫度、酸堿度等環境因素外，影響該基因導入植物受體細胞成功率的因素有農桿菌的種類和活性、受體細胞的基因型和活性等。(4)為檢測GR79基因是否導入植物體細胞，可在培養基中添加草甘膦篩選含該基因的受體細胞；也可利用核酸分子雜交技術(或PCR和核酸分子雜交技術)更加精準地進行檢測，若待檢DNA中含有該基因，則會發現硝酸纖維素膜上會出現放射性或熒光條帶。(5)獲得GR79基因的植物幼苗通過基因表達可以表現出抗草甘膦的性狀，若不具有抗草甘膦的能力，則意味著草甘膦抗性基因(GR79基因)轉錄或翻譯異常，即草甘膦抗性基因(GR79基因)表達異常。命題探究命題探究一基因工程的基本操作程序分析

1．cDNA文庫和基因組文庫的主要區別文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動子和終止子無有基因中內含子無有(真核生物)無(原核生物)基因多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因基因獲得過程mRNAcDNA→與載體組合→導入微生物細胞→克隆基因組DNA適當大小的DNA片段→與載體組合→導入微生物細胞→克隆2.三種獲取目的基因方法的比較項目化學合成法聚合酶鏈式反應(PCR)建立基因文庫法適用對象目的基因序列已知目的基因序列已知目的基因序列未知過程①以單個脫氧核苷酸為原料按照已知DNA序列直接人工合成②逆轉錄法：獲取mRNA→合成DNA單鏈→合成DNA雙鏈(目的基因)在體外通過酶促反應有選擇地大量擴增特定的DNA片段，即目的基因利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶、質粒等工具建立基因文庫→篩選出目的基因優缺點專一性強，獲取的目的基因較少速度快，以指數方式擴增操作相對簡便，但工作量大3.利用雙酶切法構建重組DNA分子雙酶切法是指用兩種能產生不同黏性末端的限制酶分別同時切割載體和含有目的基因的DNA分子，以構建重組DNA分子。由圖示可知，質粒經BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分別形成黏性末端1與2，目的基因所在的DNA分子經BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分別形成黏性末端3與4。雙酶切法的優點：①可避免載體和目的基因的自身環化(1與2不互補、3與4也不互補)；②可避免載體與目的基因的反向連接(1只與3互補，2只與4互補)。4．受體細胞拓展(1)對于植物來說，受體細胞可以是受精卵或體細胞，因為植物細胞具有全能性。(2)對于動物來說，受體細胞一般是受精卵，因為受精卵的全能性高，而高度分化的動物體細胞的全能性受到抑制。(3)大腸桿菌和酵母菌在基因工程中都可以作為受體細胞，但又有所不同。大腸桿菌為原核細胞，而酵母菌為真核細胞(具有多種細胞器)，所以在生產需要加工和分泌的蛋白質時，酵母菌比大腸桿菌更有優勢。(4)受體細胞的特點：能處于一種狀態，便于重組DNA分子導入；一般無標記基因；缺乏限制性內切核酸酶，防止重組DNA分子被降解，使其在受體細胞中穩定存在。提供Ti質粒的農桿菌與用于轉化的農桿菌受體細胞比較：用于轉化的農桿菌應為敏感菌和限制性內切核酸酶缺陷型。5．篩選含有目的基因的受體細胞(1)DNA雜交鑒定：如從受體細胞中提取DNA分子，并合成與目的基因序列互補的探針(基因探針就是用放射性同位素或熒光分子標記的含目的基因的單鏈DNA片段)，進行核酸分子雜交(如圖)。(2)鑒定該DNA分子中是否有目的基因，用限制性內切核酸酶進行酶切，做酶切圖譜鑒定。(3)利用重組質粒上的抗性基因、顯色反應、噬菌斑、營養缺陷型等進行鑒定。如以下案例：①原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果插入某種抗生素抗性基因內部，則會導致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環素抗性基因內部，則四環素抗性基因失活。②被轉化的細菌有三種：含環狀目的基因的細菌、含重組質粒的細菌、含質粒的細菌。③篩選方法：將轉化后的細菌先放在含氨芐青霉素的培養基上培養，能生長的是含重組質粒的細菌和含質粒的細菌，如圖中1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環素的培養基上，如圖，其中能生長的菌落為2、3、4，則在含四環素培養基上不生長的即為含有目的基因的菌落，即圖中的1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養基上挑取1、5菌落進行培養。6．目的基因是否表達的檢測方法(1)使用“目的基因”作探針，運用核酸分子雜交技術檢測目的基因是否轉錄出特定mRNA。(2)采用“抗原——抗體雜交技術”，從轉基因生物中提取蛋白質(作抗原)與相應抗體雜交，依據是否出現雜交帶確認目的基因是否“指導”特定蛋白質的合成。(3)采用抗蟲、抗病毒等“接種實驗”進行目的基因是否成功表達的“個體生物學”水平的檢測。例1[2023·湖北真題]用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環素抗性基因(TetR)作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體(重組質粒)，并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是(

)A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉錄的產物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環素)培養基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養基中能形成菌落D【解析】若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉錄的產物可能不同，A正確。若用PvuⅠ酶切，重組質粒和質粒中都有四環素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四環素)培養基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確。DNA凝膠電泳技術可以分離不同大小的DNA片段，重組質粒的大小與質粒不同，因此DNA凝膠電泳技術能夠鑒定重組質粒構建成功與否，C正確。SphⅠ的酶切位點位于四環素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重組質粒中含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)的培養基中能形成菌落，在含Tet的培養基中不能形成菌落，D錯誤。即時鞏固1．PCR可用于擴增并檢測DNA，但存在交叉污染或偏差等問題，而新研發的基于CRISPR/Cas12a系統的檢測方法，可在低濃度樣本中更靈敏，快速識別靶標DNA。該系統利用gRNA介導Cas12a蛋白能準確切割靶標DNA。同時切割熒光底物使其發出熒光，通過檢測熒光強度確定靶標DNA含量，利用Cas12a檢測靶標DNA的過程如下圖所示。回答下列問題。(1)根據圖中信息可推測Cas12a作用于靶標DNA時，具有類似________酶和________酶的功能；gRNA識別靶標DNA，遵循的是___________________原則。(2)在構建表達Cas12a蛋白的載體時，通常是將Cas12a基因插入lacZ基因內，使lacZ基因失活，從而失去催化無色底物顯色的能力，ampr為氨芐青霉素抗性基因。理論上通過含氨芐青霉素且不含無色底物的對應培養基培養，不能篩選到含有Cas12a基因表達載體的工程菌，判斷的依據是_____________________________________________________________限制解旋堿基互補配對使用的培養基中不含無色底物，所以在含氨芐青霉素且不含無色底________________________________________________________________________________。(3)熒光檢測時，60min后三組熒光信號強度達到一致，原因是______________________________________________________。(4)實驗研究時，增加NTC組作對照的作用是_______________________________________________________；g——3＋g——7組可更快檢測出靶標DNA，原因是______________________________________________________________________________。物的對應培養基上培養長出的菌落，無論Cas12a基因是否成功導入都不會出現顯色反應Cas12a蛋白切割熒光底物使其發出熒光的物質含量相同排除其他物質介導Cas12a蛋白切割熒光底物使其發出熒光 g——3＋g——7組在介導Cas12a蛋白切割熒光底物使其發出熒光方面具有協同作用【解析】(1)根據圖中信息可推測Cas12a作用于靶標DNA時，可以切割靶標DNA，并能解開靶標DNA雙鏈，使其與g——3和g——7結合，所以Cas12a具有類似限制酶和解旋酶的功能；gRNA識別靶標DNA，遵循的是堿基互補配對原則。(2)在構建表達Cas12a蛋白的載體時，通常是將Cas12a基因插入lacZ基因內，使lacZ基因失活，從而失去催化無色底物顯色的能力，而使用的培養基中不含無色底物，所以在含氨芐青霉素且不含無色底物的對應培養基上培養長出的菌落，無論Cas12a基因是否成功導入都不會出現顯色反應。(3)熒光檢測時，60min后三組熒光信號強度達到一致，原因是Cas12a蛋白切割熒光底物使其發出熒光的物質含量相同。(4)實驗研究時，增加NTC組作對照的作用是排除其他物質介導Cas12a蛋白切割熒光底物使其發出熒光；g——3＋g——7組可更快檢測出靶標DNA，原因是g——3＋g——7組在介導Cas12a蛋白切割熒光底物使其發出熒光方面具有協同作用。2．[2024·蕭山中學模擬]枯草芽孢桿菌可分泌纖維素酶。研究者篩選到一株降解纖維素能力較強的枯草芽孢桿菌菌株(B菌)，從中克隆得到了一種纖維素酶(C1酶)基因。將獲得的C1酶基因與高效表達載體(HT質粒)連接，再導入B菌，以期獲得降解纖維素能力更強的工程菌。(1)對克隆得到的C1酶基因測序，與數據庫中的C1酶基因編碼序列相比有兩個堿基對不同，但兩者編碼出的蛋白質的氨基酸序列相同，這是因為_________________________________________________________。(2)C1酶基因以B鏈為轉錄模板鏈，轉錄時mRNA自身的延伸方向為5′→3′。為了使C1酶基因按照正確的方向與已被酶切的HT質粒連接，克隆C1酶密碼子具有簡并性，發生堿基的改變仍然編碼同一種氨基酸基因時在其兩端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位點。該基因內部沒有這兩種酶切位點。圖1中酶切位點1和2所對應的酶分別是_________________________________。酶切后的C1酶基因需要在_____________酶的作用下與HT質粒連接構建基因表達載體。一個基因表達載體的組成必須有啟動子、終止子、復制起點、_____________、____________等。BamHⅠ、SmaⅠ(順序不能調換)DNA連接目的基因標記基因(3)轉化形成工程菌的過程中，應先用___________處理枯草芽孢桿菌，使其處于容易吸收周圍DNA的狀態。(4)將纖維素含量為20%的培養基分為三組，一組接種工程菌，對照組1不進行處理，對照組2進行相應處理。在相同條件下培養96小時，檢測培養基中纖維素的含量。圖2結果說明工程菌降解纖維素的能力最強，推測對照組2的處理應為_________________。CaCl2接種(等量)B菌(5)預期該工程菌在處理廢棄物以保護環境方面可能的應用：__________________________________________________________(舉一例)。【解析】(1)對克隆得到的C1酶基因測序，與數據庫中的C1酶基因編碼序列相比有兩個堿基對不同，但兩者編碼出的蛋白質的氨基酸序列相同，這是因為密碼子具有簡并性，發生堿基的改變仍然編碼同一種氨基酸。(2)C1酶基因以B鏈為轉錄模板鏈，轉錄時mRNA自身的延伸方向為5′→3′，即轉錄是從DNA鏈的3′端開始，再結合質粒中啟動子的方向可知，圖1中酶切位點1和2所對應的酶分別是BamHⅠ、SmaⅠ。酶切后的C1酶基因降解秸稈，減少秸稈燃燒帶來的空氣污染；處理綠色廢棄物需要在DNA連接酶的作用下與HT質粒連接構建基因表達載體。一個基因表達載體的組成必須有啟動子、終止子、復制起點、目的基因、標記基因等。(3)枯草芽孢桿菌應先用Ca2＋處理，使其處于能吸收周圍DNA的感受態狀態，有利于轉化形成工程菌。(4)將纖維素含量為20%的培養基分為三組，一組接種工程菌，對照組1不進行處理，對照組2向培養基中接種(等量)B菌。在相同條件下培養96小時，檢測培養基中纖維素的含量。結果接種工程菌的一組培養基中纖維素含量最低，說明工程菌降解纖維素的能力最強。(5)工程菌具有很強的降解纖維素的能力，因此該工程菌在處理廢棄物以保護環境方面可能的應用是降解秸稈，減少秸稈燃燒帶來的空氣污染。命題探究二PCR擴增DNA片段及凝膠電泳鑒定分析

例2[2023·浙江6月選考真題]某研究小組利用轉基因技術，將綠色熒光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實驗得到能正常表達兩種蛋白質的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3——GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設計了引物1和引物2用于PCR擴增，PCR產物電泳結果如圖乙所示。下列敘述正確的是(

)A．Gata3基因的啟動子無法控制GFP基因的表達B．翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C．2號條帶的小鼠是野生型，4號條帶的小鼠是Gata3——GFP基因純合子D．若用引物1和引物3進行PCR，能更好地區分雜合子和純合子【解析】分析題圖可知，啟動子在左側，GFP基因整合到Gata3基因的右側，啟動子啟動轉錄后，可以使GFP基因轉錄，Gata3基因的啟動子B能控制GFP基因的表達，A錯誤；因為啟動子在左側，轉錄的方向向右，合成的mRNA從左向右為5′→3′，剛好是翻譯的方向，所以翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；整合GFP基因后，核酸片段變長，2號個體只有大片段，所以是Gata3——GFP基因純合子，4號個體只有小片段，是野生型，C錯誤；用引物1和引物3進行PCR擴增，擴增出的片段大小差異較小，無法較好地區分雜合子和純合子，D錯誤。即時鞏固[2024·臺州模擬]人類γ基因啟動子上游的調控序列中含有BCL11A蛋白結合位點，該位點結合BCL11A蛋白后，基因的表達被抑制。通過改變該結合位點的序列，解除對基因表達的抑制，可對某種地中海貧血癥進行基因治療。科研人員擴增了基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達載體中進行轉化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結合位點的具體位置。相關信息如圖所示。(1)為將擴增后的產物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達，需在引物末端添加限制酶識別序列。據圖可知，在F1～F7末端添加的序列所對應的限制酶是___________，在R末端添加的序列所對應的限制酶是__________。本實驗中，從產物擴增到載體構建完成的整個過程具體需要_____種酶，它們分別是________________________________________________________________________________________。(2)將構建的載體導入除去BCL11A基因的受體細胞，成功轉化后，含F1～F6與R擴增產物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，含F7與R擴增產物的受體細胞無熒光。含F7與R擴增產物的受體細胞無熒光的原SalⅠEcoRⅠ6 TaqDNA聚合酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA連接酶因是_______________________________________________________。(3)向培養液中添加適量的雌激素，含F1～F4與R擴增產物的受體細胞不再有熒光，而含F5～F6與R擴增產物的受體細胞仍有熒光，F7與R擴增產物的受體細胞不再有熒光。若基因上游調控序列上與引物序列所對應的位置不含有BCL11A蛋白的結合位點序列，據此結果可推測，BCL11A蛋白結合位點位于_______________________________________________，理由是________________________________________________________________________________________________________________________引物F4與F5在調控序列上所對應序列之間的區段上F7與R擴增產物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達

根據有無熒光情況判斷，F1～F4與R擴增產物上均有結合位點，因此結合位點位于F4所對應調控序列的下游(右側)；F5～F6與R擴增產物_____________________________________________________________________________________________________________________________。【解析】(1)由題圖可知，熒光蛋白基因的左側為終止子，為了將擴增后的產物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達，則擴增后的產物的插入點應在熒光蛋白基因的右側，而熒光蛋白基因的右側有3個限制酶切點，分別是MunⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ限制酶的切點，但因為用EcoRⅠ酶切會破壞熒光蛋白基因，所以只能用Mun

Ⅰ和XhoⅠ限制酶切割，擴增后的產物的兩端添加限制酶后得到的DNA片段能夠替換位于MunⅠ和XhoⅠ限制酶切割位點之間的片段，并能與左側的熒光蛋白基因片段和

上均無結合位點，可知結合位點位于F5所對應調控序列的上游(左側)，所以結合位點位于引物F4與F5在調控序列上所對應序列之間的區段上右側的P片段連接起來。由于F1～F7中有XhoⅠ限制酶切割位點，所以需尋找能代替XhoⅠ限制酶，且切割后的產物能與XhoⅠ限制酶切割后的產物連接的限制酶，而SalⅠ限制酶就符合這一要求，所以在F1～F7末端添加的序列所對應的限制酶是SalⅠ；而調控序列及啟動子中含有MunⅠ的切割位點，所以需尋找能代替MunⅠ限制酶，且切割后的產物能與MunⅠ限制酶切割后的產物連接的限制酶，而EcoRⅠ限制酶就符合這一要求，所以在R末端添加的序列所對應的限制酶是EcoRⅠ。本實驗中，從產物擴增到載體構建完成的整個過程共需要TaqDNA聚合酶、SalⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、MunⅠ和DNA連接酶，共6種酶。(2)將構建的載體導入除去BCL11A基因的受體細胞，成功轉化后，含F1～F6與R擴增產物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，說明F1～F6與R擴增產物含完整的啟動子，熒光蛋白基因表達；含F7與R擴增產物的受體細胞無熒光，說明F7與R擴增產物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不能表達。(3)向培養液中添加適量的雌激素，雌激素能誘導啟動子發揮作用。構建的載體含有BCL11A基因，導入構建載體的受體細胞能合成BCL11A蛋白。含F1～F4與R擴增產物的受體細胞不再有熒光，說明F1～F4與R擴增產物上均有BCL11A蛋白的結合位點(調控啟動子，熒光蛋白基因不表達)，因此結合位點位于F4所對應調控序列的下游(右側)；而含F5～F6與R擴增產物的受體細胞仍有熒光，說明F5～F6與R擴增產物上均無結合位點(啟動子完整，熒光蛋白基因能表達)，可知結合位點位于F5所對應調控序列的上游(左側)，所以結合位點位于引物F4與F5在調控序列上所對應序列之間的區段上。課標要點三基因工程的應用與蛋白質工程主干梳理1．基因工程改善了人類的生活品質缺陷基因正常功能的基因生物反應器電泳2．蛋白質工程是基因工程的延伸基因蛋白質氨基酸核苷酸核苷酸絲氨酸3．以測序為基礎建立的基因數據庫是人類共有的財富(1)2003年____________________測序完成，我國也參與其中并做出很大的貢獻。(2)基因測序技術不斷發展，不僅________越來越快，而且________也越來越低。(3)多個國家和機構建立了龐大的___________________。①數據庫信息不僅通過互聯網共享，還定期交換數據進行更新。②現在通過訪問___________，任何人都可以方便地檢索出需要的信息。人類基因組計劃速度成本生物信息數據庫互聯網③科學家也能通過比對________或__________的序列重新審視生命進化的歷程，深度解碼個人的_____________。核酸蛋白質遺傳信息◆自我診斷◆判斷正誤(正確的打“√”，錯誤的打“×”)1．由大腸桿菌工程菌獲得人的干擾素后可直接應用。(

)2．蛋白質工程的目的是改造或合成人類需要的蛋白質。(

)3．蛋白質工程可以合成自然界中不存在的蛋白質。(

)4．利用乳腺生物反應器能夠獲得一些重要的醫藥產品，如人的血清白蛋白，這是因為將人的血清白蛋白基因導入了動物的乳腺細胞中。(

)×√√×◆精準答題◆[2023·湖南真題]基因檢測是診斷和預防遺傳病的有效手段。研究人員采集到一遺傳病家系樣本，測序后發現此家系甲和乙兩個基因存在突變：甲突變可致先天性耳聾；乙基因位于常染色體上，編碼產物可將葉酸轉化為N5——甲基四氫葉酸，乙突變與胎兒神經管缺陷(NTDs)相關；甲和乙位于非同源染色體上。家系患病情況及基因檢測結果如圖所示。不考慮染色體互換，回答下列問題。(1)此家系先天性耳聾的遺傳方式是_______________________。Ⅰ——1和Ⅰ——2生育一個甲和乙突變基因雙純合體女兒的概率是_________。(2)此家系中甲基因突變如下圖所示：正常基因單鏈片段5′——ATTCCAGATC……(293個堿基)……CCATGCCCAG——3′突變基因單鏈片段5′——ATTCCATATC……(293個堿基)……CCATGCCCAG——3′研究人員擬用PCR擴增目的基因片段，再用某限制酶(識別序列及切割位常染色體隱性遺傳病1/32點為)酶切，檢測甲基因突變情況，設計了一條引物為5′——GGCATG——3′，另一條引物為_________________________(寫出6個堿基即可)。用上述引物擴增出家系成員Ⅱ——1的目的基因片段后，其酶切產物長度應為________________bp(注：該酶切位點在目的基因片段中唯一)。(3)女性的乙基因純合突變會增加胎兒NTDs風險。葉酸在人體內不能合成，孕婦服用葉酸補充劑可降低NTDs的發生風險。建議從可能妊娠或孕前至少1個月開始補充葉酸，一般人群補充有效且安全劑量為0.4～1.0mg·d－1，NTDs生育史女性補充4mg·d－1。經基因檢測胎兒(Ⅲ——2)的5′——ATTCCA——3′8、302和310乙基因型為－/－，據此推薦該孕婦(Ⅱ——1)葉酸補充劑量為_____mg·d－1。【解析】(1)由遺傳系譜圖可知，由于Ⅰ——1與Ⅰ——2均表現正常，他們關于甲病的基因型均為＋/－，而他們的女兒Ⅱ－4患病，因此可判斷甲基因突變導致的先天性耳聾是常染色體隱性遺傳病。由Ⅰ——1、Ⅰ——2和Ⅱ——3關于乙病的基因可以推出乙基因突變導致的遺傳病也是常染色體隱性遺傳病，所以Ⅰ——1和Ⅰ——2生出一個甲和乙突變基因雙純合體女兒的概率為1/4×1/4×1/2＝1/32。(2)研究甲基因突變的情況，Ⅱ——1為雜合子，兼有正常甲基因和突變4甲基因。已知設計了一條引物為5′——GGCATG——3′，與給出的甲基因(或甲突變基因)單鏈片段的3′端互補，則另一條引物應與給出的甲基因(或甲突變基因)單鏈片段的互補鏈的3′端互補，即可以為5′——ATTCCA——3′。可擴增出大量正常甲基因和突變甲基因供后續鑒定。此時酶切，正常甲基因酶切后片段長度分別為8bp和302bp(2bp＋293bp＋7bp)，突變甲基因沒有識別序列，無法被酶切，其片段長度為310bp。(3)Ⅲ——2關于乙的基因型為－/－，有患NTDs的可能，因此推薦該孕婦(Ⅱ——1)葉酸補充劑量為4mg·d－1。命題探究命題探究一基因工程的應用

例1[2024·寧波效實中學模擬]回答下列關于轉基因技術應用的問題。(1)將山核桃miRNA169基因轉入擬南芥中，可促進擬南芥提前開花。提取山核桃根、莖、葉、雌花和果實中的RNA，經___________形成cDNA，再利用PCR技術________并擴增出大量miRNA169基因，用雙酶切法將miRNA169基因連接至表達載體，通過農桿菌轉化法轉入擬南芥愈傷組織細胞中，然后利用轉化細胞的________性，在含有抗生素和逆轉錄篩選全能_______________________________的MS培養基中經分裂、分化、器官發生和形態建成，獲得轉基因擬南芥。(2)W是一種具有特定功能的人體蛋白質。某研究小組擬仿照制備乳腺生物反應器的研究思路，制備一種膀胱生物反應器來獲得W，基本過程如下圖所示。植物生長調節物質(或植物激素)步驟①中需要使用的工具酶有________________________________。步驟②和③所代表的操作分別是____________和_________________。步驟④通常需用特定激素處理代孕母體，以使其_________________________________。與乳腺生物反應器相比，用膀胱生物反應器獲得W的優勢在于不受轉基因動物的年齡、性別以及_______________________________等的限制。(3)為培育能分泌酸性纖維素酶的乳酸菌，將乳酸菌與含酸性纖維素酶基因的重組質粒共培養，加入__________________以增大乳酸菌細胞膜的通透性，便于乳酸菌發生轉化。轉化的效率與乳酸菌的密度和生長狀態、限制性內切核酸酶與DNA連接酶顯微注射胚胎體外培養同期發情(或處于相同生理狀態)是否處于生殖期(或生長時期)氯化鈣(或Ca2＋)__________________、無菌條件、無氧條件等密切相關。將處理后的培養物進行梯度稀釋后接種至以__________為唯一碳源的平板培養基中篩選出成功轉化的乳酸菌，再采用________(填“靜置”或“振蕩”)培養法擴大培養。【解析】(1)提取得到的RNA，經過逆轉錄可以形成cDNA，但因為提取得到的RNA有多種，所以經逆轉錄形成的cDNA也有多種，可以通過PCR技術按照堿基互補配對原則篩選出特定的基因片段并進行擴增。利用轉化細胞的全能性，在MS培養基中添加抗生素和植物生長調節物質，除去農桿菌，誘導愈傷組織的分裂、分化。(2)形成重組表達載體的工具重組質粒的濃度纖維素靜置酶是限制性內切核酸酶與DNA連接酶。步驟②將重組表達載體導入受精卵，需用到顯微注射技術，步驟③為受精卵發育成早期胚胎，需經過胚胎體外培養，步驟④將早期胚胎移植入代孕母體，為保證移植胚胎的正常生長發育，需用特定激素處理代孕母體，使其處于同期發情狀態。膀胱生物反應器不受生殖期的限制，不同發育階段都能獲得產物。(3)將重組質粒導入乳酸菌時，可用氯化鈣處理細菌以增大細菌細胞膜的通透性，提高轉化成功率。轉化效率還與乳酸菌的密度和生長狀態、重組質粒的濃度、無菌條件、無氧條件等密切相關。將處理后的培養物進行梯度稀釋后接種至以纖維素為唯一碳源的平板培養基中進行篩選。實驗室中大規模培養微生物所用的培養基一般為液體培養基，乳酸菌為厭氧菌，故采用靜置培養法擴大培養。即時鞏固基因定點整合可替換特定基因，該技術可用于單基因遺傳病的治療。苯丙酮尿癥是由某基因(A)突變引起的，將正常A基因定點整合到A基因突變的小鼠胚胎干細胞的染色體DNA上，替換突變基因，可用來研究該病的基因治療過程。基因定點整合的過程如圖所示，已知neor基因可作為標記基因，含有neor的細胞具有對G418的抗性。回答下列問題。(1)構建重組載體，常用的工具酶有______________________。構建重組載體時，需要大量A基因，常用_________技術合成A基因，利用該方法合成A基因時需要設計并合成______種引物。(2)將重組載體導入患病小鼠胚胎干細胞的常用方法為______________。檢測患病小鼠胚胎干細胞中是否導入重組載體的方法是在含有________的培養液中培養胚胎干細胞。(3)用圖中重組載體轉化胚胎干細胞時，會出現A基因錯誤整合。錯誤整合時，重組載體上的兩個HSV——tk至少會有一個與neor一起整合到染色體DNA上。已知HSV——tk1、HSV——tk2的產物都把DHPG轉化成限制酶和DNA連接酶PCR兩顯微注射法G418有毒物質而使細胞死亡。將導入重組載體的胚胎干細胞置于同時含有G418和DHPG的培養液中培養，存活下來的是_____________(填“正確整合”或“錯誤整合”)的胚胎干細胞，理由是_______________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)將上述篩選得到的胚胎干細胞培育成轉基因小鼠，還需要____________________________(答出兩點)技術。【解析】(1)構建重組載體時，需要使用的工具酶為限制酶和DNA連接酶。正確整合

能在含有G418的培養液中存活，說明轉化后的胚胎干細胞中含neor，能在含DHPG的培養液中存活，說明轉化后的胚胎干細胞中不含有HSV——tk胚胎體外培養、胚胎移植大量制備A基因，即特定基因的擴增，常用PCR技術，利用PCR技術擴增基因時需要合成基因兩側的兩種不同的引物。(2)由題意可知，小鼠胚胎干細胞為受體細胞，培育轉基因動物時將重組載體導入受體細胞的常用方法為顯微注射法。由題意可知，neor為標記基因，結合題中該基因的作用可知，欲篩選含有重組載體的小鼠胚胎干細胞，應將處理后的胚胎干細胞放在含有G418的培養液中進行培養，存活下來的即為導入重組載體的胚胎干細胞。(3)由題意可知，含有neor基因的細胞具有對G418的抗性，能在含G418的培養液中存活，說明轉化后的胚胎干細胞中含neor基因。HSV——tk1、HSV——tk2的產物都能把DHPG轉化成有毒物質而使細胞死亡，故能在含DHPG的培養液中存活，說明轉化后的胚胎干細胞中不含HSV——tk，則在含有G418和DHPG的培養液中能存活的胚胎干細胞中含neor基因，而不含HSV——tk，即發生正確整合的胚胎干細胞。(4)將正確整合的胚胎干細胞培育成小鼠，還需借助胚胎工程相關操作，如胚胎體外培養、胚胎移植等技術。命題探究二蛋白質工程

蛋白質工程與基因工程的關系項目蛋白質工程基因工程區別操作過程預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→逆推出基因的脫氧核苷酸序列并改造→將改造的基因導入受體細胞并表達獲