第49講基因工程的基本工具和基本操作程序課標內容(1)闡明DNA重組技術的實現需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。(2)闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞和目的基因的檢測與鑒定等步驟。(3)DNA的粗提取與鑒定實驗。(4)利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗?？键c一重組DNA技術的基本工具1.基因工程概述基因工程的理論基礎2.重組DNA技術的基本工具(1)限制性內切核酸酶(也稱“限制酶”)①將一個基因從DNA分子上切割下來需要切兩處，同時產生四個黏性末端或平末端。②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。(2)DNA連接酶①DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合酶是把單個的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用時需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶不需要模板。(3)載體【情境推理·探究】1.實踐中常用某些病毒載體作為基因工程工具，除具備普通“質粒載體”的條件外，還應具有的條件是______________________________________________________________________________________________________(答出兩點即可)。提示對靶細胞具有較高的轉化效率，不能增殖，對細胞無害。2.限制性內切核酸酶EcoRⅠ只能識別序列—GAATTC—，并只能在G與A之間切割。若在某目的基因的兩側各有1個EcoRⅠ的切點，請畫出目的基因兩側被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。提示3.軟米基因會導致水稻稻米合成直鏈淀粉含量降低呈現軟米特征，人們大多喜歡軟米的口感，為獲得高產軟米粳型水稻，軟米基因Weq\o\al(mq,x)與蠟質基因Wx互為等位基因，序列長度相同均為557堿基對(bp)，但基因內部出現了限制酶NlaⅢ識別位點，用限制酶NlaⅢ處理不同植株的DNA片段，獲得電泳圖如下，分析可知含有純合軟米基因的植株為哪幾個？(填植株編號)軟米基因檢測結果提示1、4、5、9、10?！局攸c難點·透析】1.限制酶的選擇原則(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇SmaⅠ。(3)確保出現相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質粒，如圖中PstⅠ；為避免目的基因和質粒自身環化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。2.標記基因的作用標記基因可用于檢測目的基因是否導入受體細胞：考向圍繞基因工程的基本工具，考查科學思維1.(2023·江蘇鹽城調研)圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內切核酸酶的酶切位點，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述錯誤的是()A.在構建重組質粒時，可用PstⅠ和HindⅢ切割質粒和外源DNAB.在酶切過程中，不能破壞質粒中全部的標記基因C.若只用PstⅠ處理質粒和外源DNA分子片段，無法避免自身環化和反向連接D.導入重組質粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養基中生長答案D解析切割目的基因時，用BamHⅠ切割會破壞目的基因，只用PstⅠ切割目的基因和質粒載體，會出現目的基因和質粒的自身環化，或目的基因和質粒的反向連接，而用PstⅠ和HindⅢ進行酶切，能確保目的基因和質粒的正向連接，并且質粒上保留新霉素抗性基因作為標記基因，A、C正確；在酶切過程中，不能破壞質粒中全部的標記基因，至少需保留其中的一個，B正確；用PstⅠ切割后，質粒上氨芐青霉素抗性基因被破壞了，導入重組質粒的大腸桿菌不可以在含氨芐青霉素的培養基中生長，D錯誤。2.(2021·全國乙卷，38)用DNA重組技術可以賦予生物以新的遺傳特性，創造出更符合人類需要的生物產品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內切核酸酶的切割位點如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接。上圖中________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質粒載體片段之間形成的化學鍵是________。(3)DNA重組技術中所用的質粒載體具有一些特征。如質粒DNA分子上有復制原點，可以保證質粒在受體細胞中能________；質粒DNA分子上有________________，便于外源DNA插入；質粒DNA分子上有標記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質粒載體的宿主細胞，方法是___________________________________________________________________。(4)表達載體含有啟動子，啟動子是指_________________________________________________________________________________________________________。答案(1)EcoRⅠ、PstⅠEcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ(2)磷酸二酯鍵(3)自我復制限制酶切割位點用含有該抗生素的培養基培養宿主細胞，能夠存活的即為含有質粒載體的宿主細胞(4)RNA聚合酶識別、結合和驅動轉錄的一段DNA序列解析(1)由題圖可以看出，EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ切割后分別形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.coliDNA連接酶可用于連接黏性末端，T4DNA連接酶可用于連接黏性末端和平末端。(2)DNA連接酶催化DNA鏈的5′端與另一DNA鏈的3′端生成磷酸二酯鍵。(3)復制原點是在基因組上復制起始的一段序列，可以保證質粒在宿主細胞中進行自我復制。質粒上有限制酶切割位點，該位點可被限制酶切開并使外源目的基因插入其中。若質粒DNA分子上有某種抗生素抗性基因，則可以用含有該抗生素的培養基培養宿主細胞，能夠存活的即為含有質粒載體的宿主細胞。(4)啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質?？键c二基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取(2)利用PCR獲取和擴增目的基因①在PCR過程中實際加入的原料為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。②引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，作為新子鏈的合成起點，只能結合在母鏈的3′端，使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。③復性溫度過高，則引物難以與模板鏈結合，溫度過低則易使兩條母鏈配對結合，均無法獲得PCR產物。④真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。2.基因表達載體的構建——核心提醒啟動子、起始密碼子、終止子、終止密碼子的區別

3.將目的基因導入受體細胞只有該步驟沒涉及堿基互補配對原則(1)農桿菌特點①能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有侵染能力。②農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T-DNA轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。(2)農桿菌轉化法中的兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞的染色體DNA上；兩次導入：第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入農桿菌，第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導入受體細胞。(3)導入的目的基因，可能存在于細胞質中，也可能整合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進入雜草或其他作物中，造成“基因污染”。4.目的基因的檢測與鑒定【情境推理·探究】1.設計引物是PCR技術關鍵步驟之一。某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理(如圖)，請分別說明理由。①第1組：__________________________________________________________；②第2組：__________________________________________________________。提示引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發生堿基互補配對而失效；引物Ⅰ自身折疊后會出現局部堿基互補配對而失效。2.如果將某種抗性基因導入受體細胞后，僅一條染色體含抗性基因，該基因的傳遞遵循孟德爾分離定律。判斷依據是__________________________________________________________________________________________________________。提示僅一條染色體含有抗性基因，另一條沒有其等位基因。3.利用大腸桿菌可生產出人的胰島素，聯系前面各種細胞器功能的知識，結合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產人的胰島素，可用大腸桿菌嗎？提示不可用。大腸桿菌為原核生物，沒有真核生物所具有的內質網、高爾基體等結構，無法對核糖體合成的肽鏈進行加工?？枷?PCR技術及其應用1.(2021·湖北卷，16)某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應中非特異條帶的產生，以下措施中有效的是()A.增加模板DNA的量B.延長熱變性的時間C.延長延伸的時間D.提高復性的溫度答案D解析PCR過程中，引物和模板不完全配對會形成非特異條帶，增加模板DNA的量不會減少反應中非特異條帶的產生，A錯誤；延長熱變性的時間，有利于雙鏈DNA解聚為單鏈，不能減少反應中非特異條帶的產生，B錯誤；延長延伸的時間，有利于合成新的DNA鏈，但不能減少反應中非特異條帶的產生，C錯誤；在一定溫度范圍內，選擇較高的復性溫度可減少引物和模板間的非特異性結合，D正確。2.(2022·全國乙卷，38)新冠疫情出現后，病毒核酸檢測和疫苗接種在疫情防控中發揮了重要作用?；卮鹣铝袉栴}：(1)新冠病毒是一種RNA病毒，檢測新冠病毒RNA(核酸檢測)可以采取RT—PCR法。這種方法的基本原理是先以病毒RNA為模板合成cDNA，這一過程需要的酶是________________________，再通過PCR技術擴增相應的DNA片段。根據檢測結果判斷被檢測者是否感染新冠病毒。(2)為了確保新冠病毒核酸檢測的準確性，在設計PCR引物時必須依據新冠病毒RNA中的____________________________________來進行。PCR過程每次循環分為3步，其中溫度最低的一步是______________。(3)某人同時進行了新冠病毒核酸檢測和抗體檢測(檢測體內是否有新冠病毒抗體)，若核酸檢測結果為陰性而抗體檢測結果為陽性，說明________________________(答出1種情況即可)；若核酸檢測和抗體檢測結果均為陽性，說明_________________________________________________________。(4)常見的病毒疫苗有滅活疫苗、蛋白疫苗和重組疫苗等。已知某種病毒的特異性蛋白S(具有抗原性)的編碼序列(目的基因)。為了制備蛋白疫苗，可以通過基因工程技術獲得大量蛋白S?；蚬こ痰幕静僮髁鞒淌莀_____________________________________________________________________________________。答案(1)逆轉錄酶(或反轉錄酶)(2)特異性核苷酸序列復性(或退火)(3)曾感染新冠病毒，已康復已感染新冠病毒，是患者(4)獲取目的基因→構建基因表達載體→導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定解析(1)以病毒RNA為模板合成cDNA是逆轉錄過程，這一過程需要的酶是逆轉錄酶(或反轉錄酶)。獲得cDNA后可通過PCR技術擴增相應的DNA片段。根據檢測結果判斷被檢測者是否感染新冠病毒。(2)為確保PCR擴增獲得的是特異性序列，從而確保新冠病毒核酸檢測的準確性，設計PCR引物時必須依據新冠病毒RNA中的特異性核苷酸序列來進行。PCR過程每次循環分為3步，即變性(超過90℃)→復性(50℃左右)→延伸(72℃左右)，其中溫度最低的一步是復性(或退火)。(3)某人同時進行了新冠病毒核酸檢測和抗體檢測，若核酸檢測結果為陰性而抗體檢測結果為陽性，說明他體內沒有新冠病毒，但曾感染新冠病毒，已經康復；若核酸檢測和抗體檢測結果均為陽性，說明他體內已感染新冠病毒，是患者。(4)基因工程的基本操作流程是：獲取目的基因→構建基因表達載體→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定?？枷?結合基因工程的基本操作程序，考查科學探究能力3.(2022·廣東卷，22)“綠水逶迤去，青山相向開?！贝罅Πl展低碳經濟已成為全社會的共識?；谀承┧缶奶厥獯x能力，有研究者以某些工業廢氣(含CO2等一碳溫室氣體，多來自高污染排放企業)為原料，通過厭氧發酵生產丙酮，構建一種生產高附加值化工產品的新技術?；卮鹣铝袉栴}：(1)研究者針對每個需要擴增的酶基因(如圖)設計一對______，利用PCR技術，在優化反應條件后擴增得到目標酶基因。(2)研究者構建了一種表達載體pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因組合表達庫，經篩選后提高丙酮的合成量。該載體包括了啟動子、終止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是__________________________________________，終止子的作用是________________________________________________。(3)培養過程中發現重組梭菌大量表達上述酶蛋白時，出現了生長遲緩的現象，推測其原因可能是_________________________________________________，此外丙酮的積累會傷害細胞，需要進一步優化菌株和工藝才能擴大應用規模。(4)這種生產高附加值化工產品的新技術，實現了______________，體現了循環經濟的特點。從“碳中和”的角度看，該技術的優勢在于___________________________________________________________________，具有廣泛的應用前景和良好的社會效益。答案(1)引物(2)作為標記基因，篩選含有基因表達載體的受體細胞終止轉錄，使轉錄在需要的地方停下來(3)二氧化碳等氣體用于大量合成丙酮，而不是用于重組梭菌的生長(4)廢物的資源化不僅不排放二氧化碳，而且還可以消耗工業廢氣中的二氧化碳解析(1)利用PCR技術擴增目標酶基因，首先需要根據目標酶基因兩端的堿基序列設計一對引物，引物與模板鏈結合后，耐高溫的DNA聚合酶才能從引物的3′端延伸子鏈。(2)抗生素抗性基因是一種標記基因，其作用是將含有重組質粒的受體細胞篩選出來。終止子的作用是終止轉錄過程，使轉錄在需要的地方停下來。(3)重組梭菌大量表達上述酶蛋白時，在這些酶蛋白的作用下，二氧化碳等氣體大量用于合成丙酮，而不是用于重組梭菌的生長，所以會導致重組梭菌生長遲緩。(4)根據題意可知，這種生產高附加值化工產品的新技術，以高污染企業排放的二氧化碳等一碳溫室氣體為原料，實現了廢物的資源化，體現了循環經濟的特點。從“碳中和”的角度看，該技術生產丙酮的過程不僅不排放二氧化碳，而且還可以消耗工業廢氣中的二氧化碳，有利于減緩溫室效應，并實現較高的經濟效益，所以具有廣泛的應用前景和良好的社會效益。4.(2023·中原名校聯盟)某質粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三種限制酶切割位點，同時還含有抗四環素基因和抗氨芐青霉素基因。利用此質粒獲得轉基因抗鹽煙草的過程，如下圖所示。請回答下列問題：(1)將目的基因導入植物細胞，采用最多的方法是農桿菌轉化法。其中用到的質粒是________；該質粒含有一段特殊的DNA片段，稱為________。該方法中農桿菌的作用是_______________________________________________________。(2)在構建重組質粒時，和只用一種酶切割目的基因的兩端及質粒相比，選用HindⅢ和SalⅠ兩種酶的好處是_________________________________________________________________________________________________________。(3)含有目的基因的農桿菌可根據標記基因進行篩選。若農桿菌在含有氨芐青霉素和四環素的培養基上都可以生長繁殖，農桿菌中是否已含有目的基因？________(填“是”或“否”)。為什么？_________________________________。(4)將已經轉化的農桿菌進行如下操作，篩選出符合要求的農桿菌。先把轉化的農桿菌接種到A培養基中培養，長出菌落后，用無菌牙簽挑取A上的單個菌落，分別接種到B(含氨芐青霉素)和C(含四環素和氨芐青霉素)兩個培養基的相同位置上，一段時間后，菌落的生長狀況如圖所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？請在圖中相應的位置上圈出來。答案(1)Ti質粒T-DNA感染煙草細胞，把目的基因插入到煙草細胞的染色體DNA上(2)防止目的基因自連和質粒自連，以提高帶有目的基因的重組質粒的合成效率；防止目的基因與質粒反向連接(3)否含有目的基因的質粒中抗四環素基因被破壞(4)跳出題海如何篩選出含有目的基因的受體細胞(1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果插入某種抗生素抗性基因內部，則會導致該抗生素抗性基因失活。如下圖，目的基因插入四環素抗性基因內部，則四環素抗性基因失活。(2)被轉化的細菌有三種：含環狀目的基因的細菌、含重組質粒的細菌、含自身環化質粒的細菌。(3)篩選方法：將混合處理后的細菌先放在含氨芐青霉素的培養基上培養，能生長的是含重組質粒的細菌和含自身環化質粒的細菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用無菌的絨布影印到含有四環素的培養基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環素培養基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養基上挑取1、5菌落進行培養?？键c三DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴增及電泳鑒定1.DNA的粗提取與鑒定(2)方法步驟①加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絲狀沉淀。②本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細胞作為實驗材料，原因是哺乳動物成熟的紅細胞無細胞核(無DNA)?？蛇x用雞血細胞作為材料。2.DNA片段的擴增及電泳鑒定(1)實驗基礎(2)PCR實驗操作步驟(3)電泳鑒定：凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300__nm的紫外燈下被檢測出來。①為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。②在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，避免試劑的污染。③電泳時，DNA的相對分子量越大，遷移速率越慢；DNA的相對分子量越小，遷移速率越快?？枷?結合DNA的粗提取與鑒定，考查科學探究能力1.(2023·江蘇啟東中學檢測)如圖是“DNA的粗提取與鑒定”實驗中的兩個操作步驟示意圖，下列相關敘述正確的是()A.圖1中的溶液a是NaCl溶液B.圖1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白質等雜質不溶C.圖2所示實驗操作中有一處明顯錯誤，可能導致試管2中藍色變化不明顯D.圖2中試管1的作用是證明2(mol·L－1)的NaCl溶液遇二苯胺出現藍色答案C解析圖1所示操作為析出DNA，溶液a是研磨液過濾靜置后得到的上清液，不是NaCl溶液，A錯誤；加入預冷的酒精的目的是析出DNA、去除溶于酒精的蛋白質等雜質，原理是DNA不溶于酒精，而蛋白質等雜質能溶于酒精，B錯誤；圖2所示操作中的錯誤是試管中的液面高于水浴的液面，導致試管受熱不均勻，C正確；圖2中試管1的作用是作為對照，排除NaCl溶液對實驗結果的干擾，D錯誤?？枷?結合DNA片段的擴增及電泳鑒定，考查科學探究2.利用PCR可以在體外進行DNA片段的擴增，下列有關“DNA片段的擴增及電泳鑒定”實驗的相關敘述，錯誤的是()A.PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓蒸汽滅菌處理B.PCR利用了DNA的熱變性原理C.PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化D.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換答案C解析PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出之后，應放在冰塊上緩慢融化，這樣才能不破壞緩沖液中穩定性較差的成分，同樣保護酶的活性不被破壞，C錯誤。3.(2023·河北衡水調研)下列有關電泳的敘述，不正確的是()A.電泳是指帶電粒子在電場的作用下發生遷移的過程B.待測樣品中DNA分子的大小和構象、凝膠的濃度等都會影響DNA在電泳中的遷移速率C.進行電泳時，帶電粒子會向著與其所帶電荷相同的電極移動D.PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定答案C解析DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳，即帶電粒子在電場的作用下發生遷移的過程，A正確，C錯誤。重溫真題經典再現1.(2021·重慶卷，26)為了研究PDCD4基因對小鼠子宮內膜基質細胞凋亡的影響，進行了相關實驗。(1)取小鼠子宮時，為避免細菌污染，手術器具應進行________處理；子宮取出剪碎后，用________處理一定時間，可獲得分散的子宮內膜組織細胞，再分離獲得基質細胞用于培養。(2)培養基中營養物質應有________________(填寫兩種)；培養箱中CO2濃度為5%，其主要作用是___________________________________________________。(3)在含PDCD4基因的表達載體中，啟動子的作用是___________________________________________________________________。為了證明PDCD4基因對基質細胞凋亡的作用，以含PDCD4基因的表達載體和基質細胞的混合培養為實驗組，還應設立兩個對照組，分別為________________________________________________________________________________________________________________________________________。經檢測，實驗組中PDCD4表達水平和細胞凋亡率顯著高于對照組，說明該基因對基質細胞凋亡具有________(填“抑制”或“促進”)作用。答案(1)滅菌(或消毒)胰蛋白酶或膠原蛋白酶(2)無機鹽、葡萄糖、氨基酸、微量元素、促生長因子、血清或血漿維持培養液的pH(3)RNA聚合酶的識別和結合位點，驅動轉錄出相應的mRNA基質細胞懸浮液和空載體與基質細胞的混合培養液促進解析(1)手術器具應滅菌或消毒處理；分散動物組織細胞用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理。(2)動物細胞培養基中的營養物質有無機鹽、葡萄糖、氨基酸、微量元素、促生長因子、血清或血漿；培養箱中濃度為5%的CO2的主要作用是維持培養液的pH。(3)啟動子的作用是被RNA聚合酶識別并結合，驅動基因轉錄出相應的mRNA。要證明PDCD4基因對基質細胞凋亡的作用，實驗組是含有PDCD4基因的表達載體和基質細胞的混合培養液，為了能對比得出結果和排除載體本身與培養液的作用，對照組有兩組，一組為等量的只含基質細胞的培養液，另一組為等量的空載體(載體上無PDCD4基因)和基質細胞的混合培養液。若實驗組的細胞凋亡率高于對照組，說明PDCD4基因對基質細胞凋亡有促進作用。2.(2022·湖北卷，24改編)“端穩中國碗，裝滿中國糧”，為了育好中國種，科研人員在雜交育種與基因工程育種等領域開展了大量的研究。二倍體作物M的品系甲有抗蟲、高產等多種優良性狀，但甜度不高。為了改良品系甲，增加其甜度，育種工作者做了如下實驗：【實驗一】遺傳特性及雜交育種的研究在種質資源庫中選取乙、丙兩個高甜度的品系，用三個純合品系進行雜交實驗，結果如下表。雜交組合F1表型F2表型甲×乙不甜1/4甜、3/4不甜甲×丙甜3/4甜，1/4不甜乙×丙甜13/16甜、3/16不甜【實驗二】甜度相關基因的篩選通過對甲、乙、丙三個品系轉錄的mRNA分析，發現基因S與作物M的甜度相關?！緦嶒炄哭DS基因新品系的培育提取品系乙的mRNA，通過基因重組技術，以Ti質粒為表達載體，以品系甲的葉片外植體為受體，培育出轉S基因的新品系。根據研究組的實驗研究，回答下列問題：(1)假設不甜植株的基因型為AAbb和Aabb，則乙、丙雜交的F2中表現為甜的植株基因型有________種。品系乙基因型為________。若用乙×丙中F2不甜的植株進行自交，F3中甜∶不甜比例為________。(2)下圖中，能解釋(1)中雜交實驗結果的代謝途徑有________。(3)如圖是S基因的cDNA和載體的限制性內切核酸酶(限制性核酸內切酶)酶譜。為了成功構建重組表達載體，確保目的基因插入載體中方向正確，最好選用________________酶切割S基因的cDNA和載體。(4)用農桿菌侵染品系甲葉片外植體，其目的是______________________________________________________________________________________________。(5)除了題中所示的雜交育種和基因工程育種外，能獲得高甜度品系，同時保持甲的其他優良性狀的育種方法還有________________(答出2點即可)。答案(1)①7②aabb③1∶5(2)①③(3)XbaⅠ、HindⅢ(4)通過農桿菌的轉化作用，使目的基因進入植物細胞(5)單倍體育種、誘變育種解析(1)甲為純合不甜品系，基因型為AAbb，根據實驗一結果可推得乙基因型為aabb，丙基因型為AABB，乙、丙雜交的F2基因型有3×3＝9種，由于不甜植株的基因型為AAbb和Aabb，F2中表現為甜的植株基因型有7種。若用乙×丙中F2不甜的植株進行自交，F3中不甜比例＝1/3＋2/3×3/4＝5/6，F3中甜∶不甜比例為1∶5。(2)不甜植株的基因型為AAbb和Aabb，只有A導致不甜，當A與B同時存在時，表現為甜，故選①③。(3)為了成功構建重組表達載體，不破壞載體關鍵結構和目的基因，確保目的基因插入載體中方向正確，最好選用XbaⅠ、HindⅢ酶切割S基因的cDNA和載體。(4)用農桿菌侵染品系甲葉片外植體，可以通過農桿菌的轉化作用，使目的基因進入植物細胞。(5)除了題中所示的雜交育種和基因工程育種外，能獲得高甜度品系，同時保持甲的其他優良性狀的育種方法還有單倍體育種、誘變育種。限時強化練(時間：30分鐘)【對點強化】考點一重組DNA技術的基本工具1.(2023·山東日照期中)四種限制酶的切割位點如圖所示，下列敘述錯誤的是()A.上圖中EcoRⅠ、PstⅠ兩種酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接B.圖中SmaⅠ、EcoRV兩種酶切割后的DNA片段，可以用T4DNA連接酶連接C.DNA連接酶催化目的基因片段與質粒載體片段連接的化學鍵是磷酸二酯鍵D.限制酶能識別特定的核苷酸序列，具有專一性，不同的限制酶切割不能產生相同的黏性末端答案D解析不同的限制酶切割也可能形成相同的黏性末端，D錯誤。2.(2023·北京海淀區模擬)科研人員利用農桿菌轉化法將抗病毒蛋白基因C導入番木瓜，培育出轉基因抗病毒番木瓜，Ti質粒結構模式圖如圖所示。下列敘述正確的是()A.農桿菌的TDNA與番木瓜基因發生重組B.構建重組質粒需要限制酶和DNA聚合酶C.含重組Ti質粒的農桿菌具有四環素抗性D.轉基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性答案A解析構建重組質粒需要限制酶和DNA連接酶，B錯誤；抗病毒蛋白基因C的插入位點位于四環素抗性基因內部，插入抗病毒蛋白基因C后，重組Ti質粒的四環素抗性基因被破壞，含重組Ti質粒的農桿菌不具有四環素抗性，C錯誤；轉基因抗病番木瓜含有卡那霉素抗性基因，故轉基因抗病番木瓜具有卡那霉素抗性，D錯誤?？键c二基因工程的基本操作程序3.(2023·北京民族大學附中期末)下圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關敘述，正確的是()A.⑤只要表現出抗蟲性狀就表明植株發生了可遺傳變異B.③侵染植物細胞后，重組Ti質粒整合到④的染色體上C.④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現出抗蟲性狀D.②的構建需要限制性內切核酸酶和DNA聚合酶參與答案A解析⑤為轉基因植物，只要表現出抗蟲性狀就說明轉入的目的基因成功表達了，基因工程的原理是基因重組，屬于可遺傳變異，A正確；③侵染植物細胞后，重組Ti質粒上的TDNA整合到植物細胞的染色體上，B錯誤；受體細胞的染色體上可能含抗蟲基因，但不代表該基因就一定成功表達，因此不能確定⑤是否表現出抗蟲性狀，C錯誤；基因表達載體的構建需要限制性內切核酸酶和DNA連接酶參與，D錯誤。4.(2023·山東濟寧聯考)圖甲、乙中標注了相關限制酶的酶切位點。下列關于培育轉基因大腸桿菌的敘述錯誤的是()A.若通過PCR獲取該目的基因，應該選用引物甲和引物丙B.圖中質粒和目的基因構建表達載體，應選用BclⅠ和HindⅢ剪切C.若將基因表達載體導入受體細胞中，需選用Ca2＋轉化法D.在受體細胞中，氨芐青霉素抗性基因和目的基因可同時表達答案D解析通過PCR獲取目的基因時，兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結合，并沿相反的方向合成子鏈，故選用引物甲和引物丙，A正確；由甲圖可知，選用BamHⅠ會破壞兩種抗性基因，結合乙圖可確定應選擇BclⅠ和HindⅢ剪切，B正確；將目的基因導入大腸桿菌常采用Ca2＋轉化法，C正確；構建重組質粒時目的基因插入氨芐青霉素抗性基因中，故氨芐青霉素抗性基因被破壞不能表達，D錯誤。【綜合提升】5.(2023·河南新鄉模擬)賴氨酸是人體(成人)8種必需氨基酸之一，玉米中的賴氨酸含量比較低，其原因如圖所示。通過基因工程中的定點誘變技術，將天冬氨酸激酶(AK)的第352位蘇氨酸誘變成異亮氨酸，將二氫吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)的第104位天冬酰胺誘變成異亮氨酸，就可以使玉米葉片和種子中游離的賴氨酸分別提高5倍和2倍?；卮鹣铝袉栴}：(1)從“提升玉米種子中的賴氨酸含量”這一功能出發，預期構建出_____________________________________________________________________的結構，再推測出DHDPS基因的序列，最終合成DHDPS基因，該技術屬于________工程。(2)利用________技術可在體外大量擴增DHDPS基因，此過程需要________酶，該酶能在高溫條件下催化DNA子鏈的延伸。(3)將DHDPS基因導入玉米細胞中需要借助________________的運輸。為確保DHDPS基因能隨玉米細胞的核DNA同步復制，需要將DHDPS基因插入玉米細胞的________________________上。(4)借助________________技術，可將轉基因玉米細胞培育成轉基因植株。若要從個體水平上鑒定轉DHDPS基因的玉米育種工作是否成功，需要測定__________________________________________________________________。答案(1)二氫吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)蛋白質(2)PCR耐高溫的DNA聚合(3)基因表達載體染色體DNA(4)植物組織培養玉米種子中賴氨酸的含量解析(1)從“提升玉米種子中的賴氨酸含量”這一功能出發，預期構建出二氫吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)的結構，再推測出DHDPS基因的序列，最終合成DHDPS基因，該技術屬于蛋白質工程。(2)通常采用PCR技術擴增目的基因，該過程中需要耐高溫的DNA聚合酶的催化。(3)將目的基因導入玉米細胞中需要借助基因表達載體的運輸。要想確保目的基因在玉米細胞中隨核DNA同步復制，必須將目的基因插入玉米細胞的染色體DNA上。(4)將轉基因玉米細胞培育成轉基因植株可利用植物組織培養技術。若要從個體水平上鑒定轉DHDPS基因的玉米育種工作是否成功，需要測定玉米種子中賴氨酸的含量。6.(2023·黑龍江哈三中階段考)口服α-干擾素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。如圖1為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細胞的流程。請回答下列問題：圖1(1)步驟①中，利用PCR技術擴增干擾素基因時，設計引物序列的主要依據是_______________________________________________________________________________________________________________________________________。由于DNA復制時，子鏈只能由5′向3′方向延伸，因此可以從圖2A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取________作為引物。圖2(2)步驟②用到的農桿菌Ti質粒的功能是_________________________________。圖1過程涉及的生物工程包括植物基因工程和________，后者利用了細胞________的原理。(3)如果將干擾素基因導入哺乳動物的受精卵，早期胚胎培養至________階段，然后進行胚胎移植，可從轉基因動物分泌的乳汁中獲得干擾素，人們把這種轉基因動物稱為________。(4)干擾素體外保存相當困難，如果將其分子上的一個半胱氨酸變成絲氨酸，就可在－70℃條件下保存半年，給廣大患者帶來福音。對蛋白質進行改造，應該直接對________進行操作。原因是_____________________________________________________________