第3章基因工程第2節基因工程的基本操作程序（第2課時）導學案【科學思維】針對人類生產或生活中的某一需求，選取適當的基因工程的技術和方法，嘗試設計獲得某一轉基因產品的方案。【科學探究】嘗試進行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產物。【教學重點】DNA片段的擴增及電泳鑒定。【教學難點】DNA片段的擴增及電泳鑒定。四、目的基因的檢測與鑒定目的基因進入受體細胞后，是否穩定維持和表達其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道。1.分子水平的檢測（1）通過檢測與鑒定等技術檢測受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因或檢測目的基因是否轉錄出了mRNA。（2）抗原—抗體雜交技術：檢測目的基因是否翻譯成相應的蛋白質。2.個體生物學水平的檢測【到社會中去】1.在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉Bt基因的抗蟲棉產生了嚴重的抗性？證據是什么？科研人員對長江流域種植的轉基因抗蟲棉進行了監測，2011年的數據顯示，大部分轉基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平；2013年的數據表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護所，靶標害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對轉Bt基因的抗蟲棉產生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度等國的多個實驗室中，通過毒素的連續抗性篩選，已經培育出多個高抗水平的轉基因抗蟲棉品種。2.科研工作者在沒有發現棉鈴蟲出現抗性之前，就應該想辦法應對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個方面。（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性。包括在棉花中轉入多個殺蟲基因、構建組織特異性表達的啟動子、提高殺蟲基因的表達量等。例如，最早種植的抗蟲棉中只轉入了一種Bt基因，抗性比較單一；現在經常將兩種或兩種以上的Bt基因（如CrylAa和CrylAc基因）同時轉入棉花細胞，這樣既可以提高殺蟲活性，又可以延緩害蟲抗性的產生和發展，還可以通過不同基因間的互補作用擴大抗蟲范圍。（2）田間策略。這是在種植時采取的措施，如提供庇護所、與其他作物輪作或套種等。例如，在澳大利亞和美國等地普遍采取的措施是在轉基因棉田中，總面積的4%種植不使用任何殺蟲劑的非轉基因棉花，或在轉基因棉田周圍種植20%～30%面積的可使用化學殺蟲劑的非轉基因棉花；在印度，一些地區要求，在轉基因棉田周圍至少種植5行或者20%面積的非轉基因棉花。我國除新疆棉區及大型農場需設計專門的庇護所外，其他棉區如長江、黃河流域棉區多采用多種作物混作的耕作制度（如將轉基因抗蟲棉與番茄、向日葵、高粱、玉米、辣椒等棉鈴蟲寄主作物混作），這些作物可以構成天然的庇護所，一般無須種植非轉基因棉花作為庇護所。這樣做的原理是為少部分害蟲提供一個正常的取食環境，始終保持一定的敏感目標害蟲種群。這樣，即使目標害蟲對轉基因抗蟲棉產生了抗性，但是因為其與敏感目標害蟲交配，后代抗性基因會發生分離，所以抗性目標害蟲的種群也不至于迅速增加。（3）國家宏觀調控策略。該策略包括實施分區種植管理、加強抗性監測、進行嚴格的安全生產評價等。【探究·實踐·DNA片段的擴增及電泳鑒定】（一）實驗原理1.利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理：（1）PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合，PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器。（2）PCR擴增DNA片段還利用了DNA半保留復制的原理。一次PCR一般要經歷30次循環。2.DNA片段電泳鑒定的原理：（1）DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。（2）PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象（遷移速率與之呈負相關）等有關。（3）凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。（二）方法步驟1.DNA片段的擴增移液：用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分→離心：待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）→反應：參照下表的參數，設置好PCR儀的循環程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。循環程序變性復性延伸預變性94℃，5min//30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min預變性：使DNA充分變性，以利于_____更好地和模板結合。2.DNA片段的電泳鑒定配制瓊脂糖溶液：根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻→制備凝膠：將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜→加樣：將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物→電泳：接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳→觀察記錄：取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。（三）注意1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在－20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴增不能隨意加大試劑用量。【結果分析與評價】1.你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據是什么？可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結果。進行電泳鑒定的結果應該是一條條帶，該片段大小約為750bp。2.你進行電泳鑒定的結果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產生這個結果的可能原因。如果擴增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當等。如果擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質量不好等。【課堂作業】1.下列屬于PCR技術所需條件的是（B） ①單鏈的核苷酸序列引物②目的基因所在的DNA片段③脫氧核苷酸④核糖核苷酸⑤DNA連接酶⑥DNA聚合酶⑦限制酶A.①②③⑤ B.①②③⑥C.①②③⑤⑦ D.①②④⑤⑦2.質粒上的抗性基因在基因工程中的主要作用是（C）A.使目的基因在受體細胞內易于表達B.使受體細胞具有抗藥性C.有利于對目的基因是否導入受體細胞進行檢測D.促進目的基因與導入的外源基因相連接，提高轉基因操作的成功率3.科學家已能運用基因工程技術，讓羊合成并由乳腺分泌抗體，相關敘述中正確的是（B）①該技術將導致定向變異；②DNA連接酶能把目的基因與載體黏性末端的堿基對連接起來；③將目的基因導入受體細胞時采用顯微注射技術；④受精卵是理想的受體。A.①②④B.①③④C.②③④D.①②③④4.采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導入目的基因的方法正確的是（B）①將毒素蛋白注射到棉受精卵中；②將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中；③將編碼毒素蛋白的DNA序列與質粒重組，導入農桿菌，用該細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養；④將編碼毒素蛋白的DNA序列與細菌質粒重組，借助花粉管通道進入受精卵。A.①②B.③④C.②③D.①④5.利用人胰島B細胞構建cDNA文庫，然后通過核酸分子雜交技術從中篩選目的基因，篩選過程如下圖所示。下列說法不正確的是（C）A.cDNA文庫的構建需要用到逆轉錄酶B.圖中的菌落是