內蒙古白刺葉總黃酮提取工藝優化

摘要:采用乙醇分離純化白刺葉中的總黃酮醇苷,反相高效液相色譜法(RP-HPLC)對內蒙古白刺葉提取物中的總黃酮醇苷進行分析。RP-HPLC法測定白刺葉提取物體積分數為70%乙醇洗脫部分,流動相:V(甲醇)∶V(0.4%H3PO4溶液)=60∶40;檢測波長508nm;結果表明,乙醇純化白刺葉中的總黃酮醇苷效果良好,純度可達到18.28%。關鍵詞:白刺葉；乙醇；總黃酮醇苷內蒙古白刺葉（nitrariatangutorumBobr)為漠黎科（zy-gophyllaoeae)白刺屬植物白刺（nitraiiatangutorumBo-br)的葉，據《本草綱目》中記述，白刺“氣味辛、寒、無毒，主治心絞痛、痛腫潰膿、止痛”[1]。要分布于我國的內蒙古沙漠地區、西北沙漠地區及華北、東北沿海地區，張家口壩上、天津、滄州、壽光、東營等地都有野生白刺，資源豐富并且具有一定的藥理作用，是一種理想的天然抗氧化或防腐劑的提取來源，并且可以作為一種營養的保健成分或者是一種天然的抗氧化劑添加于其他食品中。總黃醇苷為白刺葉中的主要活性成分，本課題將對其葉片采用乙醇提取法,優選白刺葉總黃酮類的提取工藝，為白刺的進一步開發利用提供理論根據。。本方法簡便，準確，易于操作。1實驗部分1.1儀器與試劑WaterS515高效液相泵，WaterS2996DAD檢測器，WatersEmpower色譜工作站，Waters色譜柱恒溫箱，電子分析天平(梅特勒公司)，DZ^CW-C型電子恒溫水浴鍋(北京化玻醫療器械公司)，JDG-0.2真空冷凍干燥機（蘭州科近真空凍干技術有限公司)，RE52—98真空旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)，不銹鋼電熱蒸餾水器（上海申安醫療器械廠)。大孔樹脂（中國滄州遠威化工有限公司)，pH廣泛試紙。甲醇為色譜純，自制蒸餾水，NaOH，HCl,乙醇H3PO4，石油醚均為分析純。槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110081-201205)山奈素(中國藥品生物制品檢定所，批號110861-2⑴606)，異鼠李素（中國藥品生物制品檢定所，批號110861-201407)，白刺葉于2018年12月采于內蒙古西烏珠穆沁旗。1.2實驗方法1.1標準曲線的制備精密量取標準品溶液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL,分別置25mL容量瓶中,各加蒸餾水至6.0mL,加5%亞硝酸鈉溶液1mL,混勻,放置6min,加10%硝酸鋁溶液1mL,搖勻,放置6min,加40.00g/L氫氧化鈉溶液10mL,再加蒸餾水至刻度,搖勻,放置15min,以相應試劑為空白對照,用紫外可見分光光度法在508nm處測定吸光度,以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線。1.2內蒙古白刺葉黃酮類化合物的提取工藝白刺葉→恒溫干燥箱40℃烘48h干燥→粉碎→脫脂→醇回流提取→抽濾→濾液(黃酮類化合物溶液)→濃縮→定容→分析測定總黃酮類的含量。1.3黃酮類化合物樣品測定方法精確稱量白刺葉提取液1mL。加入蒸餾水5mL;加入5%亞硝酸鈉溶液1mL,搖勻并放置6min;加入5%硝酸鋁溶液1mL,搖勻并放置6min;再加入1mol/L氫氧化鈉溶液10mL;最后用蒸餾水定容至25mL,溶液搖勻放置15min。用可見分光光度計在508nm波長處測定吸光度。按上述試驗方法和步驟測其吸光度并按下式計算白刺葉黃酮類化合物的提取率:提取率(%)=提取液中黃酮類化合物質量(g)/白刺葉質量(g)[2-3]。1.4白刺葉黃酮類化合物提取的單因素試驗方法以白刺葉總黃酮類含量為考察指標,選擇乙醇濃度、料液比、浸提時間、浸提溫度作為考察的四個影響因素,每個因素設定5個梯度,每個因素的設定梯度分別為乙醇濃度55%,65%,75%,85%,95%,其他試驗條件為料液比為1∶25,浸提溫度為60℃,浸提時間為2.0h;料液比1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30,其他試驗條件為乙醇濃度為85%,浸提溫度為60℃,浸提時間為2.0h。浸提溫度50℃、60℃、70℃、80℃、90℃,其他試驗條件為乙醇濃度為85%,料液比為1∶25,浸提時間為2.0h;浸提時間0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h,其他試驗條件為乙醇濃度為85%,料液比為1∶25,浸提溫度為60℃[4-5]。1.5白刺葉黃酮類化合物提取的正交試驗方法參照單因素試驗結果,采用四因素三水平正交試驗設計,優選白刺葉黃酮類化合物提取的最佳工藝條件。2含量測定2.1槲皮素，山奈素，異鼠李素混標含量測定的色譜條件KromasilC18色譜柱（4.6mmX250mm,5Mm);流速1.0mL/min;柱溫30°C;流動相：F(甲醇）：V(0.4%H3PO4水溶液）=60:40。檢測波長360nm;見圖1。圖1白刺葉總黃酮醇苷HPLC2.1.1對照品溶液的制備精密稱取槲皮素，山奈素，異鼠李素對照品適量，加甲醇制成槲皮素濃度為0.06mg/mL，山奈素濃度為0.008mgImL和異鼠李素的濃度為0.0027mgliL的混標溶液。2.1.2供試品溶液的制備[6-7]將白刺葉總黃酮醇苷提取物準確稱取89.80mg加入V(甲醇）：V（25%的HCl溶液）=4:1混合液25mL70°C回流30min放冷。轉移至50mL容量瓶中，加甲醇到刻度，用微孔濾膜（0.45μm)濾過待用。2.1.3線性關系考察用微量進樣器分別準確吸取槲皮素，山奈素和異鼠李素混標溶液5.0，10.0，15.0，20.0，25.0μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以槲皮素，山奈素，異鼠李素混標溶液進樣體積（L)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線[8-9]。結果表明，槲皮素在0.3~1.5作線性關系良好，其回歸方程為：y=2992226.38m—1934989.5，r=0.9997。山奈素在0.04~0.2%線性關系良好。其回歸方程為：y=245431m+38000，r=0.99996。異鼠李素0.0135~0.0675%線性關系良好。其回歸方程為：y=52834.6m—3834.4，r=0.9995。2.2穩定性試驗準確吸取同一供試品溶液5μL，0，2，4，8，12h測定，槲皮素，山奈素，異鼠李素峰面積積分值RSD分別為0.65%,0.75%,0.98%2.3精密度試驗準確吸取槲皮素，山奈素，異鼠李素混標溶10%，分別重復進樣5次。峰面積積分值RSD分別為0.53%，0.53%，0.52%。2.4重復性試驗取同一樣品5份，分別按含量測定項下方法測定，記錄槲皮素，山奈素峰面積積分值，RSD分別為0.96%，0.85%和1.98%。2.5加樣回收率分別取5份的白刺葉總黃酮醇苷提取物稱取適量約0.10g，分別精密加入槲皮素，山奈素，異鼠李素對照品，照含量測定項下方法測定，平均回收率分別為97.32%，95.24%，98.10%。RSD分別為0.87%，0.69%，0.85%。2.6計算方法總黃酮醇苷含量=(槲皮素含量十山奈素含量+異鼠李素含量)X251=18.28%。3討論洗脫過程中，采用體積分數55%,65%,75%,85%,95%的乙醇洗脫，結果表明，70%洗脫效果較好，方法簡便，且容易回收。目前用大孔樹脂AB-8純化白刺總黃酮醇苷研究尚未見報道，對于白刺總黃酮醇苷的藥理活性部位，作用機理的研究都還處于初步研究階段。鑒于白刺豐富的自然資源，對白刺葉進一步有效合理地開發利用是十分必要的。參考文獻[1]李巖,劉晶,李田葉,王向紅.白刺葉提取物的抗氧化及抑菌性研究[J].食品工業,2015,36(03):94-98.[2]高喆,王佳,特布沁,王迎春.唐古特白刺葉和莖黃酮含量分析[J].中國草地學報,2014,36(03):116-120.[3]劉利平.內蒙古白刺屬四種植物營養成分分析及其評價[D].內蒙古農業大學,2009.[4]薩茹麗.沙蔥黃酮提取工藝優化、結構鑒定及其相關生物活性研究[D].內蒙古農業大學,2014.[5]孫京沙.大葉藻總黃酮的提取、純化及抗衰老活性的研究[D].中國海洋大學,2014.[6]林志欽.蓮子心總黃酮的提取純化及其功能性研究[D].福建農林大學,2012.[7]王宇希.丁香葉總黃酮的提取工藝及抑菌效果評價[D].東北農業大學,2013.[8]吳金梅.甘草總黃酮抗金黃色葡萄球菌作用及其治療奶牛乳房炎的應用研究[D