《儀器分析》課程輔導教案（光學分析和色譜分析）山東大學公共衛生學院衛生檢驗研究室邵麗華課程簡介課程簡介儀器分析是根據物質的物理和化學性質來獲取物質化學組成、含量、結構及相關信息的科學；它是分析化學的重要組成部分。隨著科學技術的發展，分析化學已由過去的經典分析方法為主轉向以儀器分析方法為主。儀器分析在醫學科學和生命科學中，對揭示生命起源、從分子水平上研究生命的過程；臨床檢驗中的配合診斷和治療疾病；預防醫學領域內的環境監測；衛生檢驗領域的職業中毒檢驗、營養成分分析等都起著重要作用。儀器分析是衛生檢驗專業的重要的專業基礎課。儀器分析課程的特點是基本理論與實踐緊密結合，通過嚴格的實驗訓練，培養認真的科學態度及獨立進行精密科學實驗的技巧，提高分析問題和處理問題的能力，為后繼課程的學習以及從事醫藥衛生和科學研究打下良好的基礎。課時安排課時安排章學時數累計學時數HYPERLINKHYPERLINK4HYPERLINK4HYPERLINK4HYPERLINK6HYPERLINK10HYPERLINK13HYPERLINK16HYPERLINK18HYPERLINK21HYPERLINK23HYPERLINK23HYPERLINK30HYPERLINK31HYPERLINK32HYPERLINK34HYPERLINK37HYPERLINK38HYPERLINK41HYPERLINK43HYPERLINK44HYPERLINK46HYPERLINK46HYPERLINK48HYPERLINK50HYPERLINK62HYPERLINK62HYPERLINK63HYPERLINK65HYPERLINK67HYPERLINK71HYPERLINK75HYPERLINK76HYPERLINK77HYPERLINK79HYPERLINK79HYPERLINK80HYPERLINK84HYPERLINK85HYPERLINK86HYPERLINK87HYPERLINK88HYPERLINK自測題 HYPERLINK拖尾"或"伸舌"現象。從而使峰展寬。（2）活性中心的影響由于載體表面不完全惰性，即使涂布少量固定液后，在它表面存在的活性中心(如酸或堿作用中心)對極性強的組分仍會產生吸附，使這些組分釋放的速度慢于其他分子而造成拖尾。解決辦法是將載體預處理，除去或減少這些活性中心。（3）柱外效應在色譜柱以外的某些因素，使譜帶展寬，降低柱的實際分離效率的現象稱為柱外效應。造成柱外效應的因素有兩類：柱前后死體積和與進樣有關的技術。前者包括較大的氣化器體積、連接管體積和檢測器死體積等；后者嚴括進樣速度慢，進樣量大及氣化溫度不夠高等。這些因素對組分在兩相中的分配系數不起任何作用，反而使組分初始帶寬增加，加劇分子擴散，造成譜帶展寬。因此，必須將柱外效應抑制到最低程度。四.色譜分離條件1．分離效果指標（1）柱效能neft↑→分配平衡次數↑→越有利于分離（2）選擇性neft大，有利于分離，但兩個色譜峰不一定能分開，能否分離取決于組分在固定相中k的差異，以選擇性表示：(19)r21↑→分離的可能性越大，無因次量，隨固定相及柱溫的變化而變化。2.總分離效能指標：分離度（又稱為分辨率）——對兩色譜峰分離程度的量度。為了綜合考慮保留值的差值與峰寬兩方面因素對柱效率的影響，以分離度作為色譜蜂的總分離效能指標：(20)分離度R定義為：相鄰二組分的色譜峰保留值之差與峰寬總和的一半的比值。式中：分子為兩組分保留值之差—由色譜體系熱力學過程決定；分母為兩峰寬度之和一半—取決于色譜體系動力學過程；當峰形不對稱或相鄰兩峰間有重疊時，峰寬度Wb測量較困難，此時可用半峰寬代替峰寬：(21)（以上兩式不完全相等，但差別很小）分離度R的值越大，說明相鄰兩組分分離效果越好。對一般分析要求R在1~1.5之間。3.基本分離方程（neft、r21、k、R之間的關系）對于兩個相鄰的色譜峰，假設峰底寬度相等，可推導出：(22)柱效因子相對分離因子保留程度因子（式中：n2為組分2的理論塔板數。）上式稱為色譜分離的基本方程式。它清楚地表明了分離度R、理論塔板n、相對保留值r2l以及分配比（容量因子）k之間的關系。（1）柱效的影響分離度R與塔板數n的平方根成正比，增加n，可以增加R。但若通過增加L來增加n，會延長分析時間，所以降低塔板高度H是增大分離度的有效途徑。實際工作中，為達到所需的分離度，根據下式可計算出給定分離度下應具有的塔板數：(23)（2）分配比的影響增大分配比k也可以增加分離度R，k是由組分色譜峰和空氣峰的相對位置決定的，它與固定相含量和流動相性質及溫度有關。（增加固定液用量雖可增大分離度，但會延長分析時間，引起色譜峰展寬）（3）相對保留值的影響r12（與固定相有關）增大，可使分離度增大。r12是由相鄰兩色譜峰的相對位置決定的，決定于固定相和流動相的性質。在氣相色譜法中：通過改變固定相來改善r12值（流動相惰性）；在液相色譜法中：通過改變流動相來改善r12值（固定相昂貴）。（當r12=1時，無論柱效有多高，R為零，兩組分不可能分離）(24)自測題1．從一張色譜流出曲線上，你能獲得那些信息？2．欲使兩種組分完全分離，必須符合那些要求？這些要求與那些因素有關？3．今有五個組分A，B，C，D和E，在氣液色譜上分配系數分別為480，360，490，496和473。試指出它們在色譜柱上的流出順序。為什么？4．下列各項對柱的塔板高度有何影響?試解釋之：(1)增大相比；(2)減小進樣速度；(3)增加氣化室的溫度；(4)提高載氣的流速；(5)減小填料的粒度；(6)降低色譜柱的柱溫。5.用色譜基本理論來解釋對載體和固定液應該具有的要求。6．用一根柱長為1m的色譜柱分離含有A，B兩個組分的混合物,它們的保留時間分別為14.4min，15.4min，其峰底寬Wb分別為1.07min，1.16min。不被保留組分的保留時間為4.2min。試計算A，B兩組分的：(1)分離度R，(2)選擇性系數rBA；(3)達到分離度1.5時所需柱長。

氣相色譜法6學時6學時基本要點：基本要點：1.了解氣相色譜的優點及適用范圍；2.理解固定相及重要操作條件的選擇；3.理解常用檢測器的原理及適用范圍；4.理解常用定性分析及定量分析方法的優點。·概述氣相色譜法（gaschromatography，GC）：以氣體為流動相的色譜分析法稱為氣相色譜法。一.氣相色譜法的分類根據所用的固定相不同可分為：氣—固色譜、氣一液色譜。按色譜分離的原理可分為：吸附色譜和分配色譜。根據所用的色譜柱內徑不同又可分為：填充柱色譜和毛細管柱色譜。二.氣相色譜法的特點它具有分離效能高、靈敏度高、選擇性好、分析速度快、用樣量少等特點，還可制備高純物質。在儀器允許的氣化條件下，凡是能夠氣化且穩定、不具腐蝕性的液體或氣體，都可用氣相色譜法分析。有的化合物沸點過高難以氣化或熱不穩定而分解，則可通過化學衍生化的方法，使其轉變成易氣化或熱穩定的物質后再進行分析。1.高效能、高選擇性性質相似的多組分混合物：同系物、同分異構體等；分離制備高純物質，純度可達99.99%。2．靈敏度高可檢出10-13-10-11g的物質；3．分析速度快幾分鐘到幾十分鐘；4．*應用范圍廣低沸點、易揮發的有機物和無機物（主要是氣體）。局限性：不適于高沸點、難揮發、熱穩定性差的高分子化合物和生物大分子化合物分析。三.氣相色譜儀主要組成部件及分析流程一般氣相色譜儀由五個部分組成：1.氣路系統：氣源、氣體凈化、氣體流量控制和測量裝置。2.進樣系統：進樣器、氣化室和控溫裝置。3.分離系統：色譜柱、柱箱和控溫裝置。4.檢測系統：檢測器和控溫裝置。5.記錄系統：記錄儀或數據處理裝置。載氣（常用N2和H2、Ar）由高壓鋼瓶供給，經減壓、凈化、調節和控制流量后進入色譜柱。待基線穩定后，即可進樣。樣品經氣化室氣化后被載氣帶入色譜柱，在柱內被分離。分離后的組分依次從色譜柱中流出，進入檢測器，檢測器將各組分的濃度或質量的變化轉變成電信號（電壓或電流）。經放大器放大后，由記錄儀或微處理機記錄電信號-時間曲線，即濃度（或質量）時間曲線即色譜圖。根據色譜圖，可對樣品中待測組分進行定性和定量分析。由此可知：色譜柱和檢測器是氣相色譜儀的兩個關鍵部件。·氣相色譜分離條件的選擇一.載氣及流速1.載氣對柱效的影響：主要表現在組分在載氣中的擴散系數Dm(g)上，它與載氣分子量的平方根成反比，即同一組分在分子量較大的載氣中有較小的Dm(g)。根據速率方程：（1）渦流擴散項與載氣流速無關；（2）當載氣流速u小時，分子擴散項對柱效的影響是主要的，因此選用分子量較大的載氣，如N2、Ar，可使組分的擴散系數Dm(g)較小，從而減小分子擴散的影響，提高柱效；（3）當載氣流速u較大時，傳質阻力項對柱效的影響起主導作用，因此選用分子量較小的氣體，如H2、He作載氣可以減小氣相傳質阻力，提高柱效。2.流速（u）對柱效的影響：從速率方程可知，分子擴散項與流速成反比，傳質阻力項與流速成正比，所以要使理論塔板高度H最小，柱效最高，必有一最佳流速。對于選定的色譜柱，在不同載氣流速下測定塔板高度，作H-u圖。由圖可見，曲線上的最低點，塔板高度最小，柱效最高。該點所對應均流速即為最佳載氣流速。在實際分析中，為了縮短分析時間，選用的載氣流速稍高于最佳流速。圖1H-u曲線二.固定液的配比又稱為液擔比。從速率方程式可知，固定液的配比主要影響Csu，降低df，可使Csu減小從而提高柱效。但固定液用量太少，易存在活性中心，致使峰形拖尾；且會引起柱容量下降，進樣量減少。在填充柱色譜中，液擔比一般為5％～25％。三.柱溫的選擇重要操作參數，主要影響來自于K、k、Dm(g)、Ds(l)；從而直接影響分離效能和分析速度。柱溫與R和t密切相關。提高t，可以改善Cu，有利于提高R，縮短t。但是提高柱溫又會增加B/u導致R降低，r21變小。但降低t又會使分析時間增長。在實際分析中應兼顧這幾方面因素，選擇原則是在是在難分離物質對能得到良好的分離，分析時間適宜且峰形不托尾的前提下，盡可能采用較低的柱溫。同時，選用的柱溫不能高于色譜柱中固定液的最高使用溫度（通常低20-50℃）。對于沸程寬的多組分混合物可采用“程序升溫法”，可以使混合物中低沸點和高沸點的組分都能獲得良好的分離。四.氣化溫度的選擇氣化溫度的選擇主要取決于待測試樣的揮發性、沸點范圍。穩定性等因素。氣化溫度一般選在組分的沸點或稍高于其沸點，以保證試樣完全氣化。對于熱穩定性較差的試樣，氣化溫度不能過高，以防試樣分解。五.色譜柱長和內徑的選擇能使待測組分達到預期的分離效果，盡可能使用較短的色譜柱。一般常用的填充柱為l～3m。填充色譜柱內徑為3～4mm。六.進樣時間和進樣量的選擇1.進樣迅速（塞子狀）——防止色譜峰擴張；2.進樣量要適當：在檢測器靈敏度允許下，盡可能少的進樣量：液體樣0.1～10ul，氣體試樣為0.1～10ml·色譜柱一.氣相色譜柱的分類色譜柱是由柱管和固定相組成，按照拄管的粗細和固定相的填充方式分為（1）填充柱；（2）毛細管柱。二.填充柱氣相色譜固定相在影響色譜柱分離效果的諸多因素中選擇適當的色譜固定相是關鍵。必須使待測各組分在選定的固定相上具有不同的吸附或分配，才能達到分離的目的。（一）氣-液色譜（分配色譜）固定相氣-液色譜的固定相是由高沸點物質固定液和惰性擔體組成。1.擔體（或載體）是一種化學惰性的多孔固體顆粒，支持固定液，表面積大，穩定性好（化學、熱），顆徑和孔徑分布均勻；有一定的機械強度，不易破碎。（1）擔體的種類和性能：硅藻土型：紅色硅藻土擔體—強度好，但表面存在活性中心，分離極性物質時色譜峰易拖尾；常用于分離非、弱極性物質。白色硅藻土擔體—表面吸附性小，但強度差，常用于分離極性物質。非硅藻土型擔體：有氟擔體，適用于強極性和腐蝕性氣體的分析；玻璃微球，適合于高沸點物質的分析；高分子多孔微球既可以用作氣-固色譜的吸附劑，又可以用作氣-液色譜的擔體。

(2)擔體的預處理：除去其表面的活性中心，使之鈍化。酸洗法（除去堿性活性基團）；堿洗法（除去酸性活性的基團）；硅烷化（消除氫鍵結合力）；釉化處理（使表面玻璃化、堵住微孔）等。2．固定液——涂在擔體上作固定相的主成分（l）對固定液的要求：化學穩定性好：不與擔體、載氣和待測組分發生反應；熱穩定性好：在操作溫度下呈液體狀態，蒸氣壓低，不易流失；選擇性高：分配系數K差別大；溶解性好：固定液對待測組分應有一定的溶解度。（2）組分與固定液分子間的相互作用：組分與固定液分子間相互作用力通常包括：靜電力、誘導力、色散力和氫鍵作用力。在氣-液色譜中，只有當組分與固定液分子間的作用力大于組分分子間的作用力，組分才能在固定液中進行分配。選擇適宜的固定液使待側各組分與固定液之間的作用力有差異，才能達到彼此分離的目的。（3）固定液的分類：固定液有四百余種，常用相對極性分類。（a）規定強極性的，’-氧二丙腈的相對極性P=100；（b）規定非極性的角鯊烷（異三十烷）的相對極性P=0；（c）其它固定液與它們比較，測相對極性：選一物質對正丁烷—丁二烯分別測得它們在這兩種固定液及被測柱上的相對保留值q：(1)則，被測固定液的相對極性Px為：(2)q1、q2、qx分別為物質對正丁烷—丁二烯在氧二丙腈、異三十烷、被測柱上的相對保留值。把P=0～100之間分為五級，20為一級，以“＋”表示。＋l、＋2為弱極性；＋3為中等極性；＋4、＋5為強極性。通常把非極性固定液的相對極性以“－”表之。如阿皮松L級別為“－”，是非極性固定液；鄰苯二甲酸壬酯級別為“＋2”，是弱極性固定液。（4）固定液的選擇：一般是根據試樣的性質（極性和官能團），按照“相似相溶”的原則選擇適當的固定液。具體可從以下幾方面考慮：l）分離非極性混合物一般選用非極性固定液組分和固定液分子間的作用力主要是色散力。試樣中各組分按沸點由低到高的順序出峰。常用的有：角鯊烷（異三十烷）、十六烷、硅油等；2）分離中等極性混合物一般選用中等極性固定液組分和固定液分子間的作用力主要是色散力和誘導力。試樣中各組分按沸點由低到高的順序出峰。3）分離極性組分選用極性固定液組分和固定液分子間的作用力主要是定向力。待測試樣中各組分按極性由小到大的順序出峰。例如：用極性固定液聚乙二醇一20M分析乙醛和丙烯醛時，極性較小的乙醛先出峰。4）分離非極性和極性(易極化)組分的混合物選用極性固定液：非極性組分先流出，極性（或易被極化）的組分后出峰。例如：采用中等極性的鄰苯二甲酸二壬酯作固定液，沸點相差極小的苯（沸點80.l℃）和環乙烷（沸點為80.8℃）可以定量分離，環己烷先出峰，若采用非極性固定液則很難使二者分離。5）對于能形成氫鍵的組分選用強極性或氫鍵型的固定液如：多元醇、腈醚、酚和胺等的分離，不易形成氫鍵的先出峰。（二）氣-固（吸附）色譜固定相——固體吸附劑1.活性炭：非極性吸附劑，分析低碳烴和氣體及短鏈極性化合物。2.氧化鋁：弱（中等）極性吸附劑，主要用于分析C1~C4烴類及其異構體。3.硅膠：強極性吸附劑，常用于分析硫化物：COS、H2S、SO2等。4.分子篩（人工合成的硅酸鹽）：強極性吸附劑，用于在室溫條件下使H2，O2，N2，CH4，CO得到良好分離。5.高分子多孔微球：極性和非極性吸附劑，可分析極性的—多元醇、脂肪酸、腈類、胺類或非極性的—烴、醚、酮等；尤其適合分析有機物中的微量水。·氣相色譜檢測器待測組分經色譜柱分離后，通過檢測器將各組分的濃度或質量轉變成相應的電信號，經放大器放大后，由記錄儀或微處理機得到色譜圖，根據色譜圖對待測組分進行定性和定量分析。氣相色譜監測器根據其測定范圍可分為：通用型檢測器：對絕大多數物質夠有響應；選擇型檢測器：只對某些物質有響應；對其它物質無響應或很小。根據檢測器的輸出信號與組分含量間的關系不同，可分為：濃度型檢測器：測量載氣中組分濃度的瞬間變化，檢測器的響應值與組分在載氣中的濃度成正比，與單位時間內組分進入檢測器的質量無關。質量型檢測器：測量載氣中某組分進入檢測器的質量流速變化，即檢測器的響應值與單位時間內進人檢測器某組分的質量成正比目前已有幾十種檢測器，其中最常用的是熱導池檢測器、電子捕獲檢測器（濃度型）；火焰離子化檢測器、火焰光度檢測器（質量型）和氮磷檢測器等。一．檢測器的性能指標——靈敏度（高）、穩定性（好）、響應（快）、線性范圍（寬）（一）靈敏度——應答值單位物質量通過檢測器時產生的信號大小稱為檢測器對該物質的靈敏度。響應信號(R)—進樣量(Q)作圖，可得到通過原點的直線，該直線的斜率就是檢測器的靈敏度，以S表示：(3)由此可知：靈敏度是響應信號對進入檢測器的被測物質質量的變化率。氣相色譜檢測器的靈敏度的單位，隨檢測器的類型和試樣的狀態不同而異：對于濃度型檢測器：當試樣為液體時，S的單位為mV·ml/mg，即1mL載氣中攜帶1mg的某組分通過檢測器時產生的mV數；當試樣為氣體時，S的單位為mV·ml／ml，即1ml載氣中攜帶1ml的某組分通過檢測器時產生的mV數；對于質量型檢測器：當試樣為液體和氣體時，S的單位均為：mV·s／g，即每秒鐘有1g的組分被載氣攜帶通過檢測器所產生的mV數。靈敏度不能全面地表明一個檢測器的優劣，因為它沒有反映檢測器的噪音水平。由于信號可以被放大器任意放大，S增大的同時噪聲也相應增大，因此，僅用S不能正確評價檢測器的性能。（二）檢測限（敏感度）噪聲——當只有載氣通過檢測器時，記錄儀上的基線波動稱為噪聲，以RN表示。噪聲大，表明檢測器的穩定性差。檢測限——是指檢測器產生的信號恰是噪聲的二倍（2RN）時，單位體積或單位時間內進入檢測器的組分質量，以D表示。靈敏度、噪聲、檢測限三者之間的關系為：(4)檢測限的單位：對于濃度型檢測器為mg／ml或ml／ml；對質量型檢測器為：g/s。檢測限是檢測器的重要性能指標，它表示檢測器所能檢出的最小組分量，主要受靈敏度和噪聲影響。D越小，表明檢測器越敏感，用于痕量分析的性能越好。在實際分析中，由于進入檢測器的組分量很難確定（檢測器總是處在與氣化室、色譜柱、記錄系統等構成的一個完整的色譜體系中）。所以常用最低檢出量表示：圖2檢測器噪聲（三）最低檢出量——恰能產生2倍噪聲信號時的色譜進樣量，以Q0表示。（三）線性范圍檢測器的線性范圍是指其響應信號與被測組分進樣質量或濃度呈線性關系的范圍。通常用最大允許進樣量QM與最小檢出量Q0的比值來表示。比值越大，檢測器的線性范圍越寬，表明試樣中的大量組分或微量組分，檢測器都能準確測定。二.（氫）火焰離子化檢測器火焰離子化檢測器是根據氣體的導電率是與該氣體中所含帶電離子的濃度呈正比這一事實而設計的。一般情況下，組分蒸汽不導電，但在能源作用下，組分蒸汽可被電離生成帶電離子而導電。火焰離子化檢測器的結構：該檢測器主要是由離子室、離子頭和氣體供應三部分組成。結構示意圖見下圖。圖3火焰離子化檢測器離子室是一金屬圓筒，氣體入口在離子室的底部，氫氣和載氣按一定的比例混合后，由噴嘴噴出，再與助燃氣空氣混合，點燃形成氫火焰。靠近火焰噴嘴處有一圓環狀的發射極（通常是由鉑絲作成），噴嘴的上方為一加有恒定電壓（+300V）的圓筒形收集極（不銹鋼制成），形成靜電場，從而使火焰中生成的帶電離子能被對應的電極所吸引而產生電流。2.火焰離子化檢測器的工作原理由色譜柱流出的載氣（樣品）流經溫度高達2100℃的氫火焰時，待測有機物組分在火焰中發生離子化作用，使兩個電極之間出現一定量的正、負離子，在電場的作用下，正、負離子各被相應電極所收集。當載氣中不含待測物時，火焰中離子很少，即基流很小，約10-14A。當待測有機物通過檢測器時，火焰中電離的離子增多，電流增大（但很微弱10-8～10-12A）。需經高電阻（108～l011）后得到較大的電壓信號，再由放大器放大，才能在記錄儀上顯示出足夠大的色譜峰。該電流的大小，在一定范圍內與單位時間內進入檢測器的待測組分的質量成正比，所以火焰離子化檢測器是質量型檢測器。火焰離子化檢測器對電離勢低于H2的有機物產生響應，而對無機物、久性氣體和水基本上無響應，所以火焰離子化檢測器只能分析有機物（含碳化合物），不適于分析惰性氣體、空氣、水、CO、CO2、CS2、NO、SO2及H2S等。三.電子捕獲檢測器1.電子捕獲檢測器的結構：早期電子捕獲檢測器由兩個平行電極制成。現多用放射性同軸電極。在檢測器池體內，裝有一個不銹鋼棒作為正極，一個圓筒狀-放射源（3H、63Ni）作負極，兩極間施加流電或脈沖電壓。圖4電子捕獲檢測器2.電子捕獲檢測器的工作原理當純載氣（通常用高純N2）進入檢測室時，受射線照射，電離產生正離子（N2+）和電子e-，生成的正離子和電子在電場作用下分別向兩極運動，形成約10-8A的電流——基流。加入樣品后，若樣品中含有某中電負性強的元素即易于電子結合的分子時，就會捕獲這些低能電子，產生帶負電荷陰離子（電子捕獲）這些陰離子和載氣電離生成的正離子結合生成中性化合物，被載氣帶出檢測室外，從而使基流降低，產生負信號，形成倒峰。倒峰大小（高低）與組分濃度呈正比，因此，電子捕獲檢測器是濃度型的檢測器。其最小檢測濃度可達10-14g/ml，線性范圍為103左右。電子捕獲檢測器是一種高選擇性檢測器。高選擇性是指只對含有電負性強的元素的物質，如含有鹵素、S、P、N等的化合物等有響應.物質電負性越強，檢測靈敏度越高。四.火焰光度檢測器火焰光度檢測器是利用在一定外界條件下（即在富氫條件下燃燒）促使一些物質產生化學發光，通過波長選擇、光信號接收，經放大把物質及其含量和特征的信號聯系起來的一個裝置。1．火焰光度檢測器的結構燃燒室、單色器、光電倍增管、石英片（保護濾光片）及電源和放大器等。圖5火焰光度檢測器2.工作原理當含S、P化合物進入氫焰離子室時，在富氫焰中燃燒，有機含硫化合物首先氧化成SO2，被氫還原成S原子后生成激發態的S2*分子，當其回到基態時，發射出350～430nm的特征分子光譜，最大吸收波長為394nm。通過相應的濾光片，由光電倍增管接收，經放大后由記錄儀記錄其色譜峰。此檢測器對含S化合物不成線性關系而呈對數關系（與含S化合物濃度的平方根成正比）。當含磷化合物氧化成磷的氧化物，被富氫焰中的H還原成HPO裂片，此裂片被激發后發射出480～600nm的特征分子光譜，最大吸收波長為526nm。因發射光的強度（響應信號）正比于HPO濃度。·氣相色譜定性定量分析一．定性分析氣相色譜的優點是能對多種組分的混合物進行分離分析，（這是光譜、質譜法所不能的）。但由于能用于色譜分析的物質很多，不同組分在同一固定相上色譜峰出現時間可能相同，進憑色譜峰對未知物定性有一定困難。對于一個未知樣品，首先要了解它的來源、性質、分析目的；在此基礎上，對樣品可有初步估計；再結合已知純物質或有關的色譜定性參考數據，用一定的方法進行定性鑒定。（一）利用保留值定性1.已知物對照法各種組分在給定的色譜柱上都有確定的保留值，可以作為定性指標。即通過比較已知純物質和未知組分的保留值定性。如待測組分的保留值與在相同色譜條件下測得的已知純物質的保留值相同，則可以初步認為它們是屬同一種物質。由于兩種組分在同一色譜柱上可能有相同的保留值，只用一根色譜往定性，結果不可靠。可采用另一根極性不同的色譜柱進行定性，比較未知組分和已知純物質在兩根色譜柱上的保留值，如果都具有相同的保留值，即可認為未知組分與已知純物質為同一種物質。利用純物質對照定性，首先要對試樣的組分有初步了解，預先準備用于對照的已知純物質（標準對照品）。該方法簡便，是氣相色譜定性中最常用的定性方法。2.相對保留值法對于一些組成比較簡單的已知范圍的混合物或無已知物時，可選定一基準物按文獻報道的色譜條件進行實驗，計算兩組分的相對保留值：(5)式中：i-未知組分；s-基準物。并與文獻值比較，若二者相同，則可認為是同一物質。（ris僅隨固定液及柱溫變化而變化。）可選用易于得到的純品，而且與被分析組分的保留值相近的物質作基準物。2.保留指數法又稱為Kovats指數，與其它保留數據相比，是一種重現性較好的定性參數。保留指數是將正構烷烴作為標準物，把一個組分的保留行為換算成相當于含有幾個碳的正構烷烴的保留行為來描述，這個相對指數稱為保留指數，定義式如下：(6)

IX為待測組分的保留指數，z與z+n為正構烷烴對的碳數。規定正己烷、正庚烷及正辛烷等的保留指數為600、700、800，其它類推。在有關文獻給定的操作條件下，將選定的標準和待測組分混合后進行色譜實驗（要求被測組分的保留值在兩個相鄰的正構烷烴的保留值之間）。由上式計算則待測組分X的保留指數IX，再與文獻值對照，即可定性。3.聯用技術氣相色譜對多組分復雜混合物的分離效率很高，但定性卻很困難。而質譜、紅外光譜和核磁共振等是鑒別未知物的有力工具，但要求所分析的試樣組分很純。因此，將氣相色譜與質譜、紅外光譜、核磁共振譜聯用，復雜的混合物先經氣相色譜分離成單一組分后，再利用質譜儀、紅外光譜儀或核磁共振譜儀進行定性。未知物經色譜分離后，質譜可以很快地給出未知組分的相對分子質量和電離碎片，提供是否含有某些元素或基團的信息。紅外光譜也可很快得到未知組分所含各類基團的信息。對結構堅定提供可靠的論據。近年來，隨著電子計算機技術的應用，大大促進了氣相色譜法與其它方法聯用技術的發展。二．定量分析在一定的色譜操作條件下，流入檢測器的待測組分i的含量mi（質量或濃度）與檢測器的響應信號（峰面積A或峰高h）成正比：mi=fiAi或mi=fihi式中，fi為定量校正因子。要準確進行定量分析，必須準確地測量響應信號，確求出定量校正因子fi。此兩式是色譜定量分析的理論依據。1．峰面積的測量(1)峰高乘半峰寬法：對于對稱色譜峰，可用下式計算峰面積：(7)

在相對計算時，系數1.06可約去。（2）峰高乘平均峰寬法：(8)對于不對稱峰的測量，在峰高0.15和0.85處分別測出峰寬，由下式計算峰面積：此法測量時比較麻煩，但計算結果較準確。（3）自動積分法具有微處理機（工作站、數據站等），能自動測量色譜峰面積，對不同形狀的色譜峰可以采用相應的計算程序自動計算，得出準確的結果，并由打印機打出保留時間和A或h等數據。2.定量校正因子由于同一檢測器對不同物質的響應值不同，所以當相同質量的不同物質通過檢測器時，產生的峰面積（或峰高）不一定相等。為使峰面積能夠準確地反映待測組分的含量，就必須先用已知量的待測組分測定在所用色譜條件下的峰面積，以計算定量校正因子。(9)

式中：fi稱為絕對校正因子，即是單位峰面積所相當的物質量。它與檢測器性能、組分和流動相性質及操作條件有關，不易準確測量。在定量分析中常用相對校正因子，即某一組分與標準物質的絕對校正因子之比，即：(10)式中：Ai、As分別為組分和標準物質的峰面積；mi、ms分別為組分和標準物質的量。mi、ms可以用質量或摩爾質量為單位，其所得的相對校正因子分別稱為相對質量校正因子和相對摩爾校正因子，用fm和fM表示。使用時常將“相對”二字省去。校正因子一般都由實驗者自己測定。準確稱取組分和標準物，配制成溶液，取一定體積注入色譜柱，經分離后，測得各組分的峰面積，再由上式計算fm或fM。4.定量方法（1）歸一化法：如果試樣中所有組分均能流出色譜柱，并在檢測器上都有響應信號，都能出現色譜峰，可用此法計算各待測組分的含量。其計算公式如下：(11)

歸一化法簡便，準確，進樣量多少不影響定量的準確性，操作條件的變動對結果的影響也較小，尤其適用多組分的同時測定。但若試樣中有的組分不能出峰，則不能采用此法。（2）內標法：內標法是在試樣中加入一定量的純物質作為內標物來測定組分的含量。內標物應選用試樣中不存在的純物質，其色譜峰應位于待測組分色譜峰附近或幾個待測組分色譜峰的中間，并與待測組分完全分離，內標物的加入量也應接近試樣中待測組分的含量。具體作法是準確稱取m（g）試樣，加入ms（g）內標物，根據試樣和內標物的質量比及相應的峰面積之比，由下式計算待測組分的含量：(12)(13)

由于內標法中以內標物為基準，則fs=1。內標法的優點是定量準確。因為該法是用待測組分和內標物的峰面積的相對值進行計算，所以不要求嚴格控制進樣量和操作條件，試樣中含有不出峰的組分時也能使用，但每次分析都要準確稱取或量取試樣和內標物的量，比較費時。為了減少稱量和測定校正因子可采用內標標準曲線法——簡化內標法：在一定實驗條件下，待測組分的含量mi與Ai／As成正比例。先用待測組分的純品配置一系列已知濃度的標準溶液，加入相同量的內標物；再將同樣量的內標物加入到同體積的待測樣品溶液中，分別進樣，測出Ai/As，作Ai/As—m或Ai/As—C圖，由Ai（樣）/As即可從標準曲線上查得待測組分的含量。（3）外標法：取待測試樣的純物質配成一系列不同濃度的標準溶液，分別取一定體積，進樣分析。從色譜圖上測出峰面積（或峰高），以峰面積（或峰高）對含量作圖即為標準曲線。然后在相同的色譜操作條件，分析待測試樣，從色譜圖上測出試樣的峰面積（或峰高），由上述標準曲線查出待測組分的含量。外標法是最常用的定量方法。其優點是操作簡便，不需要測定校正因子，計算簡單。結果的準確性主要取決于進樣的重視性和色譜操作條件的穩定性。·毛細管柱氣相色譜法最早的毛細管柱亦稱空心柱，是一種又細又長，形同毛細管的開放式管柱，固定液涂在毛細管內壁上。（柱長：5-100m，內經：0.1-0.7mm）一．毛細管柱的類1.涂壁空心柱(wall-coatedopentublarcolumn，WCOT柱）固定液直接涂在毛細管內壁上，最早的毛細管柱。2.多孔層柱（porous-layeropentublarcolumn，PLOT柱）吸附型多孔層柱：在管壁上涂一層多孔材料，如分子篩、氧化鋁、熔融石英及高分子多孔微球等。分配型多孔層柱：將普通的載體沉于表面，在涂布合適的固定液二．毛細管柱氣相色譜儀與普通色譜儀的不同處：氣路系統：加一尾吹裝置——減少柱后死體積，改善柱效；進樣系統：進樣量的準確性（分流、不分流、冷柱頭等）。三.毛細管柱的優缺點1.總柱效高

毛細管柱內徑一般為0.1~0.7mm,內壁固定液膜極薄,中心是空的,因阻力很小,而且渦流擴散項不存在,譜帶展寬變小.由于毛細管柱的阻力很小,長可為填充柱的幾十倍,其總柱效比填充柱高得多.

2.分析速度快

毛細管柱的相比約為填充柱的數十倍。由于液膜極薄,分配比k很小，相比大，組分在固定相中的傳質速度極快,因此有利于提高柱效和分析速度。它可在1小時內分離出包含一百多種化合物的汽油成分；可在幾分鐘內分離十幾個化合物。3.柱容量小毛細管柱的相比高,k必然很小,因此使最大允許進樣量受到限制,對單個組分而言,約0.5ug就達到極限.為將極微量樣品導人毛細管柱,一般需采用分流進樣法。此法就是將均勻揮發的樣品進行不等量的分流,只讓極小部分樣品(約幾十分之一或幾百分之一)進入柱內。進入柱內的樣品量占注射樣品量的比例稱為“分流比”。·頂空氣相色譜法“頂空氣相色譜法”是一種測定液體或固體樣品中揮發性組分的氣相色譜。方法原理：樣品于有一定頂端空間的密閉容器中，在一定溫度和壓力下，待測揮發組分在兩相達動態平衡時，根據烏拉爾定律：(14)Pi—組分i在氣相中的蒸氣壓；Pi0—純組分i的飽和蒸氣壓；i—組分i的活度系數；當實驗條件固定，且試液中組分濃度很低時，Pi0、i均為常數；Xi—組分i在該溶液中物質的量；k—為組分i對檢測器特性的校正系數，在條件穩定時為常數當用組分i的濃度ci代替式中物質的量Xi時，在測定條件下：(15)·氣相色譜法的應用只要在氣相色譜儀允許的條件下可以氣化而不分解的物質，都可以用氣相色譜法測定。對部分熱不穩定物質，或難以氣化的物質，通過化學衍生化的方法，仍可用氣相色譜法分析。在石油化工、醫藥衛生、環境監測、生物化學等領域都得到了廣泛的應用1．在衛生檢驗中的應用空氣、水中污染物如揮發性有機物、多環芳烴[苯、甲苯、苯并（a）比等]；農作物中殘留有機氯、有機磷農藥等；食品添加劑苯甲酸等；體液和組織等生物材料的分析如氨基酸、脂肪酸、維生素等。2．在醫學檢驗中的應用體液和組織等生物材料的分析：如脂肪酸、甘油三酯、維生素、糖類等。3.在藥物分析中的應用抗癲癇藥、中成藥中揮發性成分、生物堿類藥品的測定等。4.商品檢驗下圖為一種香水的成分分析。色譜柱為化學鍵合交聯毛細管柱，固定液位PEG-20M，柱長30m，內徑0.25mm，鍵合相層厚度0.25m，采用程序升溫方式：66自測題1．氣相色譜定性分析的依據是什么？為什么要引入定量校正因子？什么是外標法、內標法和歸一化法？簡述它們的適用范圍和各自的優缺點？2．在氣相色譜分析中，為了測定下列物質，各應選擇那種檢測器為宜？農作物中含氯農藥的殘留量；（2）啤酒中微量硫化物的含量；（3）分離和分析苯和甲苯異構體。3．用內標法測定環氧丙烷中的水分含量，稱取0.0115g甲醇。加到2.267g試樣中，測得水分和甲醇的色譜峰高分別為148.8和172.3mm。水和甲醇（內標物）的相對質量校正因子分別為0.55和0.58，試計算水的質量分數。

高效液相色譜法4學時4學時基本要點：基本要點：1.了解高效液相色譜法的優點及適用范圍；2.了解高效液相色譜儀的主要部件及高效液相色譜法基本流程；3.理解常用檢測器的原理、適用的分析對象及適用范圍；4.理解各種分離方式的原理及選擇原則。·概述高效液相色譜法（highperformanc，liquidchromatography，HPLC）是在經典液相色譜法基礎上發展起來的一種新型分離、分析技術。經典液相色譜法由于使用粗顆粒的固定相，填充不均勻，依靠重力使流動相流動，因此分析速度慢，分離效率低。新型高效的固定相、高壓輸液泵、梯度洗脫技術以及各種高靈敏度的檢測器相繼發明，高效液相色譜法迅速發展起來。高效液相色譜法與經典液相色譜法比較，具有下列主要特點：1．高效由于使用了細顆粒、高效率的固定相和均勻填充技術，高效液相色譜法分離效率極高，柱效一般可達每米104理論塔板。近幾年來出現的微型填充柱（內徑lmm）和毛細管液相色譜柱（內徑0.05umm），理論塔板數超過每米105，能實現高效的分離。2．高速由于使用高壓泵輸送流動相，采用梯度洗脫裝置，用檢測器在柱后直接檢測洗脫組分等，HPLC完成一次分離分析一般只需幾分鐘到幾十分鐘，比經典液相色譜快得多。3．高靈敏度紫外、熒光、電化學、質譜等高靈敏度檢測器的使用，使HPLC的最小檢測量可達10-9～10-11g4．高度自動化計算機的應用，使HPLC不僅能自動處理數據、繪圖和打印分析結果，而且還可以自動控制色譜條件，使色譜系統自始至終都在最佳狀態下工作，成為全自動化的儀器。5．應用范圍廣（與氣相色譜法相比）HPLC可用于高沸點、相對分子質量大、熱穩定性差的有機化合物及各種離子的分離分析。如氨基酸、蛋白質、生物堿、核酸、甾體、維生素、抗生素等。6．流動相可選擇范圍廣它可用多種溶劑作流動相，通過改變流動相組成來改善分離效果，因此對于性質和結構類似的物質分離的可能性比氣相色譜法更大。7．餾分容易收集更有利于制備。·高效液相色譜儀高效液相色譜儀主要有分析型、制備型和專用型三類。一般由五個部分組成：高壓輸液系統——進樣系統——分離系統——檢測系統——數據處理系統一.高壓輸液系統貯液裝置、高壓輸液泵、過濾器、脫氣裝置等1.貯液器：貯液器用于存放溶劑。溶劑必須很純，貯液器材料要耐腐蝕，對溶劑呈惰性。貯液器應配有溶劑過濾器，以防止流動相中的顆粒進入泵內。溶劑過濾器一般用耐腐蝕的鎳合金制成，空隙大小一般為2m。2.脫氣裝置：脫氣的目的是為了防止流動相從高壓柱內流出時，釋放出氣泡進入檢測器而使噪聲劇增，甚至不能正常檢測。3.高壓輸液泵高壓輸液泵是高效液相色譜儀的重要部件，是驅動溶劑和樣品通過色譜柱和檢測系統的高壓源，其性能好壞直接影響分析結果的可靠性。對高壓泵的基本要求是：①流量穩定；②輸出壓力高，最高輸出壓力為50Mpa；③流量范圍寬，可在0.01～10ml／min范圍任選。④耐酸、堿、緩沖液腐蝕。⑤壓力波動小。2.梯度洗脫裝置梯度洗脫是利用兩種或兩種以上的溶劑，按照一定時間程序連續或階段地改變配比濃度，以達到改變流動相極性、離子強度或pH值，從而提高洗脫能力，改善分離的一種有效方法。當一個樣品混合物的容量因子是范圍很寬，用等度洗脫時間太長，且后出的峰形扁平不便檢測時，用梯度洗脫可以改善峰形、并縮短分離時間。HPLC的梯度洗脫與GC的程序升溫相似，可以縮短分析時間，提高分離效果。使所有的峰都處于最佳分離狀態，而且峰形尖而窄。二.進樣器進樣器一般要求密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統的壓力和流量波動小，并便于實現自動化。高壓進樣閥是目前廣泛采用的一種方式。閥的種類很多，有六通閥、四通閥，雙路閥等。以六通進樣閥最為常用。三.分離系統色譜分離系統包括色譜柱、固定相和流動相。色譜柱是其核心部分，柱應具備耐高壓、耐腐蝕、抗氧化、密封不漏液和柱內死體積小、柱效高、柱容量大、分析速度快、柱壽命長的要求。通常采用優質不銹鋼管制成。色譜柱按內徑不同可分為常規柱、快速柱和微量柱三類。常規分析柱柱長一般為10~25cm，內徑4~5mm，固定相顆粒直徑為5~10m。為了保護分析柱不受污染，一般在分析柱前加一短柱，約數厘米長，稱為保護柱。（微量分析柱內徑小于lmm，凝膠色譜往內徑3～12mm，制備往內徑較大，可達25mm以上。）四.檢測系統檢測器的作用是將柱流出物中樣品組成和含量的變化轉化為可供檢測的信號，常用檢測器有紫外吸收、熒光、示差折光、化學發光等。1.紫外可見吸收檢測器（ultraviolet－visibledetector，UVD）紫外可見吸收檢測器（UVD）是HPLC中應用最廣泛的檢測器之一，幾乎所有的液相色譜儀都配有這種檢測器。其特點是靈敏度較高，線性范圍寬，噪聲低，適用于梯度洗脫，對強吸收物質檢測限可達1ng，檢測后不破壞樣品，可用于制備，并能與任何檢測器串聯使用。紫外可見檢測器的工作原理與結構同一般分光光度計相似，實際上就是裝有流動地的紫外可見光度計。（1）紫外吸收檢測器：紫外吸收檢測器常用氘燈作光源，氘燈則發射出紫外-可見區范圍的連續波長，并安裝一個光柵型單色器，其波長選擇范圍寬（190nm～800nm）。它有兩個流通池，一個作參比，一個作測量用，光源發出的紫外光照射到流通池上，若兩流通池都通過純的均勻溶劑，則它們在紫外波長下幾乎無吸收，光電管上接受到的輻射強度相等，無信號輸出。當組分進入測量池時，吸收一定的紫外光，使兩光電管接受到的輻射強度不等，這時有信號輸出，輸出信號大小與組分濃度有關。局限：流動相的選擇受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶劑不能做流動相，每種溶劑都有截止波長，當小于該截止波長的紫外光通過溶劑時，溶劑的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收檢測器的工作波長不能小于溶劑的截止波長（2）光電二極管陣列檢測器（photodiodearraydetector，PDAD）：也稱快速掃描紫外可見分光檢測器，是一種新型的光吸收式檢測器。它采用光電二極管陣列作為檢測元件，構成多通道并行工作，同時檢測由光柵分光，再入射到陣列式接收器上的全部波長的光信號，然后對二極管陣列快速掃描采集數據，得到吸收值(A)是保留時間(tR)和波長()函數的三維色譜光譜圖。由此可及時觀察與每一組分的色譜圖相應的光譜數據，從而迅速決定具有最佳選擇性和靈敏度的波長。下圖是單光束二極管陣列檢測器的光路圖。光源發出的光先通過檢測池，透射光由全息光柵色散成多色光，射到陣列元件上，使所有波長的光在接收器上同時被檢測。陣列式接收器上的光信號用電子學的方法快速掃描提取出來，每幅圖象僅需要10ms，遠遠超過色譜流出峰的速度，因此可隨峰掃描。圖1二極管陣列檢測器光路圖2．熒光檢測器（fluorescencedetector，FD）熒光檢測器是一種高靈敏度、有選擇性的檢測器，可檢測能產生熒光的化合物。某些不發熒光的物質可通過化學衍生化生成熒光衍生物，再進行熒光檢測。其最小檢測濃度可達0.1ng／ml，適用于痕量分析；一般情況下熒光檢測器的靈敏度比紫外檢測器約高2個數量級，但其線性范圍不如紫外檢測器寬。近年來，采用激光作為熒光檢測器的光源而產生的激光誘導熒光檢測器極大地增強了熒光檢測的信噪比，因而具有很高的靈敏度，在痕量和超痕量分析中得到廣泛應用。3.示差折光檢測器（differentialrefractiveIndexdetector，RID）示差折光檢測器是一種濃度型通用檢測器，對所有溶質都有響應，某些不能用選擇性檢測器檢測的組分，如高分子化合物、糖類、脂肪烷烴等，可用示差檢測器檢測。示差檢測器是基于連續測定樣品流路和參比流路之間折射率的變化來測定樣品含量的。光從一種介質進入另一種介質時，由于兩種物質的折射率不同就會產生折射。只要樣品組分與流動相的折光指數不同，就可被檢測，二者相差愈大，靈敏度愈高，在一定濃度范圍內檢測器的輸出與溶質濃度成正比。4.電化學檢測器（elec）chemicaldetector，ED）電化學檢測器主要有安培、極譜、庫侖、電位、電導等檢測器，屬選擇性檢測器，可檢測具有電活性的化合物。目前它已在各種無機和有機陰陽離子、生物組織和體液的代謝物、食品添加劑、環境污染物、生化制品、農藥及醫藥等的測定中獲得了廣泛的應用。其中，電導檢測器在離子色譜中應用最多。電化學檢測器的優點是：①靈敏度高，最小檢測量～般為ng級，有目可達pg級；②選擇性好，可測定大量非電活性物質中極痕量的電活性物質；③線性范圍寬，一般為4～5個數量級；④設備簡單，成本較低；⑤易于自動操作。5.化學發光檢測器（c。iluminescencedetector，CD）化學發光檢測器是近年來發展起來的一種快速、靈敏的新型檢測器，因其設備簡單、價廉、線性范圍寬等優點。其原理是基于某些物質在常溫下進行化學反應，生成處于激發態勢反應中間體或反應產物，當它們從激發態返回基態時，就發射出光子。由于物質激發態的能量是來自化學反應，故叫作化學發光。當分離組分從色譜柱中洗脫出來后，立即與適當的化學發光試劑混合，引起化學反應，導致發光物質產生輻射，其光強度與該物質的濃度成正比。這種檢測器不需要光源，也不需要復雜的光學系統，只要有恒流泵，將化學發光試劑以一定的流速泵入混合器中，使之與柱流出物迅速而又均勻地混合產生化學發光，通過光電倍增管將光信號變成電信號，就可進行檢測。這種檢測器的最小檢出量可達10-12g。五.數據處理系統早期的HPLC只配有記錄儀記錄色譜峰，用人工計算A或H。隨著計算機技術的發展，簡單的積分儀，可自動打印出H、A和tR，作一些簡單的計算，但不能存儲數據。現在的色譜工作站功能增多，一般包括：色譜參數的選擇和設定：自動化操作儀器；色譜數據的采集和存儲，并作“實時”處理；對采集和存儲的數據進行后處理；自動打印，給出一套完整的色譜分析數據和圖譜。同時也可把一些常用色譜參數、操作程序，及各種定量計算方法存入存儲器中，需用時調出直接使用。·色譜分離條件選擇一.減小柱內展寬，提高柱效l.固定相：①粒度小，均勻，以減小渦流擴散和流動相傳質阻力；②改進結構，盡可能采用大孔徑和淺孔道的表面多孔型載體或全多孔微粒型載體，減少滯留流動相傳質阻力。2.流動相：選用低粘度的流動相，有利于增大組分在溶劑中的擴散系數Dm，減少傳質阻力。3.流速：從H-U曲線可知，HPLC的最佳流速在流速很小處，減少流速有利于提高柱效，但在實踐中為加快分析速度，常采用比最佳流速高數倍的流速。圖2氣相色譜(GC)和液相色譜(LC)的H-u曲線比較4.柱溫：適當提高柱溫，可降低流動相粘度，減少傳質阻力，但柱溫升高將使分辨率降低，柱壽命短，易產生氣泡，一般在室溫下進行。二.柱外展寬柱外譜帶展寬又稱“柱外效應”，系指從進樣點到檢測池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起的色譜峰展寬，柱效下降。可分為：1．柱前展寬主要由進樣引起，減小進樣器的死體積，用閥門進樣可減少柱前譜帶展寬，提高柱效。2．柱后展寬主要由接管、檢測器流通池體積及檢測器響應時間等因素所引起。因此，盡可能用短而內徑細的接管，減少流通池體積，改進檢測器和記錄系統的響應速度等都是克服柱后展寬的途徑。·液-固色譜法一.原理液-固色譜法”是利用各組分在固定相上吸附能力的不同而將它們分離的方法。當組分隨著流動相通過色譜柱中的吸附劑時，組分分子及流動相分子對吸附劑表面的活性中心發生吸附競爭。組分分子對活性中心的競爭能力的大小決定了它們保留值的大小。被活性中心吸附越強的組分分子越不容易被流動相洗脫，k值就大；反之k值就小。組分之間的k值相差越大，分離越容易。吸附劑吸附能力的強弱與吸附劑的比表面積、物理化學性質、組分分子的結構和組成以及流動相的性質等因素有關。二.固定相液-固吸附色譜所使用的固定相，多數是有吸附活性的吸附劑，常用的有表面多孔型和全多孔微粒型硅膠、氧化鋁、分子篩等。1.表面多孔型：又稱薄殼型，是高效液相色譜使用的第一種填料。表面多孔填料的機械強度好，易填充均勻、緊密，滲透性好，表面孔隙淺，傳質快，柱效高，分離速度快。其主要缺點是由于比表面積小，柱容量低，允許進樣量小。2.全多孔微粒型：目前廣泛使用的有球形和無定形兩種，顆粒直徑3～10um，它具有粒度小，比表面積大（100～600m2／g），孔穴淺，柱效高和柱容量大的優點。三.流動相實現最佳分離與流動相的選擇有關。溶劑的極性是重要的依據。溶劑的極性強弱可用溶劑強度參數0來衡量。0越大，表示洗脫劑的極性越強。吸附色譜流動相的選擇原則是極性大的試樣需用極性強的洗脫劑，極性弱的試樣宜用極性較弱的洗脫劑。實際工作中常用兩種或兩種以上溶劑按不同比例混合作洗脫劑，以提供合適的溶劑強度和k值，提高分離的選擇性。在分離復雜試樣時，可進行梯度洗脫，能提高分離效率，改善峰形，加快分析速度。（高效液相色譜法中，流動相選擇雖然有一般的指導原則，但主要靠實踐經驗。）·化學鍵合相色譜法一.原理“化學鍵合相色譜法”——采用化學鍵合相作固定相的液相色譜法。化學鍵合相是利用化學反應通過共價鍵將有機分子鍵合在載體（硅膠）表面，形成均一、牢固的單分子薄層而構成的固定相。其分離機理為吸附和分配兩種機理兼有。對多數鍵合相來說，以分配機理為主。通常，化學鍵合相的載體是硅膠，硅膠表面有硅醇基，≡Si–OH，它能與合適的有機化合物反應，獲得各種不同性能的化學鍵合相。從鍵合反應的性質可分為：酯化鍵合（≡Si-O-C）、硅氮鍵合（≡Si-N）和硅烷化鍵合（≡Si-O-Si-C）等；硅烷化鍵合相應用最廣泛。這種鍵合相是用有機氯硅烷與硅醇基發生反應：≡Si–OH+C18H37SiCl3→≡Si-O–Si–C18H37+HCl∣這種固定相在pH=2～8.5范圍內對水穩定，有機分子與載體間的結合牢固，固定相不易流失穩定性好。十八烷基硅烷鍵合相（Octadecylsilane簡稱ODS或C18）：是最常用的非極性鍵合相。它們用于反相色譜法，在70℃以下和pH2～8范圍內可正常工作。化學鍵合固定相具有如下優點：①柱效高：傳質速度比一般液體固定相快；②穩定性：耐溶劑沖洗，耐高溫，無固定液流失，從而提高了色譜柱的穩定性和使用壽命；應用范圍廣：改變鍵合有機分子的結構和基團的類型，能靈活地改變分離的選擇性，適用于分離幾乎所有類型的化合物；且能用各種溶劑作流動相（梯度洗脫）。二.流動相化學鍵合相色譜所用流動相的極性必須與固定相顯著不同，根據流動相和固定相的相對極性不同分為：1.正相鍵合相色譜法：流動相極性小于固定相極性。常用非極性溶劑如烷烴類溶劑，樣品組分的保留值可用加入適當的有機溶劑（調節劑）的辦法調節洗脫強度。常用有機溶劑為極性溶劑如氯仿、二氯甲烷、已腈、醇類等。適用于分離中等極性化合物，如脂溶性維生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有機氯農藥等。2.反相鍵合相色譜法：流動相極性大于固定相極性。流動相多以水或無機鹽緩沖液為主體，再加入一種能與水相混溶的有機溶劑（如甲醇、乙睛、四氫呋喃等）為調節，根據分離需要，改變洗脫劑的組成及含量，以調節極性和洗脫能力。在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。固定相一般為C18、C8。反相鍵合相色譜法應用最廣泛，因為它以水為底溶劑，在水中可以加入各種添加劑，改變流動相的離子強度、pH值和極性等，以提高選擇性，而且水的紫外截至波長低，有利痕量組分的檢測，反向鍵合相穩定性好，不易被強極性組分污染，且水廉價易得，安全。·離子交換色譜法一.原理離子交換色譜的固定相是交換劑，根據交換劑性質可分為：陽離子交換劑和陰離子交換劑。交換劑由固定的離子基團和可交換的平衡離子組成。當流動相帶著組分離子通過離子交換柱時，組分離子與交換劑上可交換的平衡離子進行