ICS

點(diǎn)擊此處添加中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類號(hào)

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—XXXX

常見動(dòng)物源性成分快速測(cè)定膜芯片法

Rapiddetectionofanimal-derivedMaterials—Membrane-basedarrayMethod

點(diǎn)擊此處添加與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí)

（征求意見稿）

GB/TXXXXX—XXXX

常見動(dòng)物源性成分快速測(cè)定膜芯片法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬、黃牛、羊、雞、鴨、兔、驢、貂、狐、鼠、牦牛等常見動(dòng)物源性成分膜芯片檢測(cè)

方法的原理、試樣制備與保存、試劑與儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)方法和流程、生物安全措施、結(jié)果判讀、確證實(shí)

驗(yàn)、結(jié)果表述。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于肉制品及飼料中11種常見動(dòng)物源性成分的快速和定性檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T14699.1飼料采樣

GB/T19495.1轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)通用要求和定義

GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要

GB/T19495.7轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)抽樣和制樣方法

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備

GB/T25165明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法

GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)

SN/T3730（所有部分）食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法

3術(shù)語(yǔ)和縮略語(yǔ)

下列術(shù)語(yǔ)和縮略語(yǔ)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

dNTP：脫氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）

dATP：脫氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）

dCTP：脫氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）

dGTP：脫氧鳥苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）

dTTP：脫氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）

dUTP：脫氧尿苷三磷酸（deoxyuridinetriphosphate）

bp：堿基對(duì)（basepair）

1

GB/TXXXXX—XXXX

18SrRNA：線粒體18SrRNA基因（18SribosomalRNA）

COXⅠ：線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ基因（CytochromecoxidasesubunitI）

Cytb：線粒體細(xì)胞色素b基因（Cytochromeb）

ATPase6：ATP合成酶亞基6（ATPsynthase6）

D-loop：線粒體D-LOOP區(qū)域

PC：陽(yáng)性對(duì)照（Positivecontrol）

NC：陰性對(duì)照（Negativecontrol）

Taq:ThermusAquaticusDNA聚合酶(ThermusAquaticusDNApolymerase)

UDG酶：尿嘧啶-N-糖基化酶(UracilN-glycocasylase)

Biotin：生物素修飾基團(tuán)

AminolinkerC6：6個(gè)碳原子作為連接臂的氨基標(biāo)記（C6Aminolinker）

4原理

待檢樣品經(jīng)抽樣記錄后，提取DNA模板。針對(duì)食品及飼料中常見動(dòng)物源性成分進(jìn)行特異性基因片

段設(shè)計(jì)引物，對(duì)提取DNA模板進(jìn)行多重不對(duì)稱PCR擴(kuò)增。PCR引物上修飾有生物素，若樣本中含有

目標(biāo)片段而得到PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與固定有目標(biāo)基因特異性探針的膜芯片進(jìn)行雜交，經(jīng)化學(xué)顯

色后可在雜交點(diǎn)上形成肉眼可見的雜交信號(hào)。依據(jù)膜芯片上的雜交點(diǎn)顯色情況，判斷樣本中是否含有待

檢動(dòng)物源性成分，檢測(cè)結(jié)果可以用肉眼直接判斷，或用芯片掃描儀對(duì)雜交芯片進(jìn)行掃描并判定結(jié)果。

5試樣制備與保存

5.1抽樣方法

按GB/T14699.1規(guī)定的方法進(jìn)行樣品采集。

5.2樣品制備

5.2.1食品樣品制備

從原始樣品中取出部分有代表性樣品，將可食部分用絞碎機(jī)絞碎，充分混勻，用四分法縮分出不少

于500g作為試樣。裝入清潔容器中，加封后，標(biāo)明標(biāo)記。

5.2.2飼料樣品制備

按GB/T20195的規(guī)定制備試樣。選取有代表性飼料樣品至少500g，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過孔徑為

0.2mm的標(biāo)準(zhǔn)篩。混勻后，裝入清潔容器內(nèi)保存，防止交叉污染。

5.3樣品保存

2

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5.3.1食品樣品保存

將樣品于-20℃冷凍保存。

5.3.2飼料樣品保存

將樣品于4℃避光保存。

6試劑

6.1試劑組分

試劑組分和存放條件參見附錄A。除非另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的三

級(jí)水。

6.2引物

PCR反應(yīng)使用的引物序列應(yīng)符合表1的規(guī)定。

表1PCR反應(yīng)使用的引物序列

擴(kuò)增片段大小

物種目標(biāo)基因引物名稱序列5‘-3‘

（bp）

Forward5'-AGCCTGAGAAACGGCTACC-3'

內(nèi)參18SrRNA180

Reverse5'-biotin-TGCTGGCACCAGACTTGC-3'

Forward5'-ACCGTAGGAATAGACGTG-3'

豬COXⅠ154

Reverse5'-biotin-TGAAGCCCAGAGCTCATAG-3'

Forward5'-TTACAACAATTATCAACATAA-3'

黃牛COXⅠ174

Reverse5'-biotin-CCGGGTCGAAGAAGGTTGTA-3'

Forward5'-GGCCTATACTATGGATCATATAC-3'

羊Cytb159

Reverse5'-biotin-AATTGCTGAAAGGAGGTTGGT-3'

Forward5'-CCACCTCACCTTCCTACAC-3'

雞Cytb77

Reverse5'-biotin-GAAATGGAATTTTGTCA-3'

Forward5'-ACAGAAGGAAACCGAA-3'

鴨ATPase6112

Reverse5'-biotin-TCCGATGATCACGTGGAGTCC-3'

Forward5'-GAAACTGGCTCCAACAAC-3'

兔Cytb96

Reverse5'-biotin-AAGGAAACCTAGGGTGTCTTTG-3'

3

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Forward5'-TACGCTCCATTCCCAACAAA-3'

驢Cytb134

Reverse5'-biotin-TTTTGACATGTGTAGGGTAGGG-3'

Forward5'-GTCATCTCAGCACTAGCAG-3'

貂Cytb107

Reverse5'-biotin-TAGGGGTGAAAGGGGATTT-3'

Forward5'-TTTGCCCACTGATTCCCCTT-3'

狐ATPase693

Reverse5'-biotin-CATGTTCACCCCTACGAATAT-3'

Forward5'-ACATACGAAAAACACACC-3'

鼠Cytb107

Reverse5'-biotin-TCCTAGAAGGGACCCAA-3'

Forward5’-CTAACAACACACATCCCCAA-3’

牦牛D-loop175

Reverse5’-TTATGTACGATTAATAATT-3’

6.3探針

芯片表面包被的目標(biāo)基因探針序列應(yīng)符合表2的規(guī)定。

表2目標(biāo)基因探針序列

名稱序列修飾基團(tuán)

18SrRNA5'-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3'5'-AminolinkerC6

豬5'-GAGCATACTTTACATCTGCCACAATAATCATTGCTATTCCC-3'5'-AminolinkerC6

黃牛5'-AACCCCTCTATTCGTATGATCCG-3'5'-AminolinkerC6

羊5'-TGGATCATATACCTTCCTAGAAACATG-3'5'-AminolinkerC6

雞5'-CCTAGGCATCTCATCCGACTC-3'5'-AminolinkerC6

鴨5'-ACCGCCCTACAAGCAATAGAGTACCATG-3'5'-AminolinkerC6

兔5'-ACAACCCCACAGGAATTCCTTCAAAC-3'5'-AminolinkerC6

驢5'-GCCCTTATCCTTTCCATCTTAATCCTAG-3'5'-AminolinkerC6

貂5'-GGAATCCCATCTGATTCAGAC-3'5'-AminolinkerC6

狐5'-GGGCTACACCCTAAATGACACCTG-3'5'-AminolinkerC6

鼠5'-AAAATTATTAACCACTCAT-3'5'-AminolinkerC6

牦牛5’-CGGAGGAGAATGCTGTTGTTGTATCGGATGT-35'-AminolinkerC6

5'-GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTGTC

PC5'-AminolinkerC6

CAAAGTACCAG-3'

5'-GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGATGAT

NC5'-AminolinkerC6

CCTATTTTC-3'

注：陽(yáng)性寡核苷酸單鏈DNA(Positive-Oligo,10μM)：核苷酸序列與陽(yáng)性對(duì)照核酸探針（PC）序列互補(bǔ)，用于膜芯片雜交

過程質(zhì)量控制，5’端帶生物素（biotin）標(biāo)記，序列如下：

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5'-biotin-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3'

6.4其他試劑

6.4.120xSSPE緩沖液：3mmolNaCl，200mmol/LNaH2PO4，20mmol/LEDTA，pH7.4。

6.4.2十二烷基磺酸鈉（SDS）。

6.4.3乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na，C10H14N2Na2O8）。

6.4.4氫氧化鈉（NaOH）。

6.4.5氯化鈉（NaCl）。

6.4.6磷酸二氫鈉（NaH2PO4.H2O）。

6.4.7多重PCR即用型預(yù)混液（MultiplexPCRMasterMix）。

6.4.8多重PCR引物預(yù)混液（MultiplexPCRPrimerMix）：每條引物2μmol。

6.4.9堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素(AP-streptavidin)。

6.4.10堿性磷酸酶化學(xué)顯色底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑蘭（NBT/BCIP）。

6.4.11去活化液：100mmol/LNaOH。

6.4.12去活化清洗液：2xSSPE，0.1%SDS。

6.4.13雜交液：2xSSPE，0.1%SDS。

6.4.14雜交清洗液：2xSSPE，0.5%SDS。

6.4.15酶孵育液：2xSSPE，0.5%SDS。

6.4.16孵育洗液1：2xSSPE，0.5%SDS。

6.4.17孵育洗液2：2xSSPE。

6.4.18底物顯色液：堿性磷酸酶化學(xué)顯色底物NBT/BCIP，含0.15mg/mLBCIP，0.30mg/mLNBT，

100mmol/LTris-HCl，5mmol/LMgCl2，pH9.5。

6.4.19苯酚。

6.4.20三氯甲烷。

6.4.21異戊醇。

6.4.22異丙醇。

6.4.23CTAB緩沖液：10%CTAB(m/v)，十六烷基三甲基溴化銨。

6.4.24蛋白酶K，20mg/ml。

6.4.25RNA酶，10mg/ml。

6.4.26TE緩沖液，10mMTris-HCl1mMEDTApH8.0。

5

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6.4.27乙醇。

6.4.28膜芯片耗材：尼龍膜，BiodyneC型號(hào)，厚度0.45μm。

7儀器與設(shè)備

7.1基因擴(kuò)增儀。

7.2膜芯片識(shí)讀儀。

7.3臺(tái)式離心機(jī)：轉(zhuǎn)速12000rpm。

7.4旋渦儀。

7.5恒溫水浴鍋。

7.6膜芯片自動(dòng)雜交儀。

7.7微量移液器及槍頭。

7.8核酸微量分光光度計(jì)。

7.9純水儀。

7.10分析天平：準(zhǔn)確到0.001g。

8實(shí)驗(yàn)方法和流程

8.1膜芯片法檢測(cè)流程

膜芯片法檢測(cè)流程見附錄B。

8.2樣品

8.2.1實(shí)驗(yàn)室樣品代表性應(yīng)符合GB/T19495.7的規(guī)定。

8.2.2實(shí)驗(yàn)室樣品及測(cè)試樣品的保存應(yīng)按照GB/T19495.1的規(guī)定執(zhí)行。

8.2.3所有測(cè)試樣品的制備操作應(yīng)按照GB/T19495.2的規(guī)定執(zhí)行。

8.3樣品制備

8.3.1DNA提取

稱取50mg已制備好的樣品于2mL離心管中，加入1000μLCTAB緩沖液和40μL蛋白酶K，振蕩

混勻，65℃30min，期間每隔10min振蕩混勻。12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移1mL上清液至2mL離心管

中。加入500μL苯酚、三氯甲烷和異戊醇的混合液，體積比為25:24:1，強(qiáng)烈振蕩，12000rpm離心15min。

加入200μL三氯甲烷-異戊醇（24:1），強(qiáng)烈振蕩，12000rpm離心15min。吸取上清液至一新離心管中，

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加入等體積異丙醇，振蕩均勻，12000rpm離心10min。棄去上清液，70%乙醇洗滌一次，12000rpm離

心1min。棄上清液，晾干，用預(yù)熱至65℃的TE緩沖液溶解DNA。加入5μLRNA酶溶液，37℃30min。

同一天內(nèi)使用的DNA在4℃保存，2天后使用的DNA保存于-20℃。長(zhǎng)期保存的DNA置于-80℃。

可采用同等效果的動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒。每個(gè)測(cè)試樣品提取時(shí)應(yīng)做兩個(gè)提取重復(fù)。

8.3.2DNA濃度測(cè)定

取適量DNA溶液原液加雙蒸水稀釋一定倍數(shù)后，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)測(cè)260nm

和280nm處的吸收值，DNA的濃度按式（1）計(jì)算：

c=A260*N*50/1000…(1)

公式中：

c-----DNA濃度，單位為微克每毫升（ug/μL）；

A260-----260nm處的吸光值；

N-----核酸稀釋倍數(shù)。

當(dāng)濃度為10ug/mL，A260/A280比值在1.7-1.9之間時(shí)，適宜PCR擴(kuò)增。

8.4PCR擴(kuò)增

8.4.1PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系配制見表3。每次實(shí)驗(yàn)中，利用已知含有11種動(dòng)物源性成分基因組DNA作為陽(yáng)性質(zhì)控，

已知不含有該11種動(dòng)物源成分基因組DNA作為陰性質(zhì)控，用緩沖液或水代替樣品進(jìn)行核酸提取作為空

白質(zhì)控。將8.3.1的核酸提取物加入到PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。

表3PCR反應(yīng)體系（體積50μL）

反應(yīng)液組成檢測(cè)反應(yīng)陽(yáng)性質(zhì)控陰性質(zhì)控空白質(zhì)控

MultiplexPCRMasterMix25μL25μL25μL25μL

MultiplexPCRprimerMix5μL5μL5μL5μL

檢測(cè)樣品基因組DNA200ng//

含有已知?jiǎng)游镌椿蚪MDNA/200ng//

不含有動(dòng)物源成分基因組DNA//200ng/

核酸提取空白///10μL

無核酸酶滅菌水補(bǔ)充至50μL補(bǔ)充至50μL補(bǔ)充至50μL補(bǔ)充至50μL

注：PCR體系最終含有MgCl21.5mmol/L，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP各0.2mmol/L，UDG

酶1U，Taq酶2U，每條引物終濃度0.2μmol/L。

8.4.2PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)

PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置見表4。

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表4PCR反應(yīng)參數(shù)

步驟溫度反應(yīng)時(shí)間

137℃10min

295℃10min

395℃30s

455℃30s

572℃15s

3、4、5循環(huán)35次

672℃10min

7（推薦）4℃保溫

8.5膜芯片雜交

8.5.1膜芯片制備

膜芯片制作與質(zhì)量控制見附錄C。

8.5.2雜交體系

雜交體系液配制見表5。

表5雜交體系

組份體積（μL）

雜交液（2×SSPE，0.1%SDS）949

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物50

陽(yáng)性寡核苷酸單鏈DNA(Positive-Oligo，10μmol/L)1

總體積1000

8.5.3酶孵育體系

酶孵育體系液配制見表6，使用時(shí)重新配制。

表6酶孵育體系

組份體積（μL）

孵育液（2×SSPE，0.5%SDS）999.5

堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素（AP-streptavidin）0.5

總體積1000

8.5.4雜交、酶聯(lián)及顯色

8.5.4.1雜交檢測(cè)方式

可選擇手動(dòng)雜交或自動(dòng)雜交儀。

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8.5.4.2手動(dòng)雜交

將膜芯片置于雜交盒內(nèi)，按表7進(jìn)行手動(dòng)雜交。雜交過程在分子雜交爐中進(jìn)行，類似儀器應(yīng)滿足實(shí)

驗(yàn)要求。

表7膜芯片手動(dòng)雜交過程

過程名稱步驟

去活化加入去活化液1mL，37℃，8min，吸除去活化液。

去活化清洗加入去活化清洗液1mL，60℃，5min，吸除去活化清洗液。

雜交加入雜交體系液1mL，42℃，45min，吸除雜交體系液。

雜交清洗(2次)加入雜交清洗液1mL，52℃，5min，吸除雜交清洗液，該過程重復(fù)2次。

酶孵育加入酶孵育體系液1mL，42℃，30min，吸除酶孵育體系液。

孵育清洗1(2次)加入孵育清洗液1（1mL），42℃，5min，吸除孵育清洗液1，該過程重復(fù)2次。

孵育清洗2(2次)加入孵育清洗液2（1mL），37℃，5min，吸除孵育清洗液2，該過程重復(fù)2次。

顯色加入顯色液1mL，37℃，靜止顯色15min，吸除顯色液。

顯色清洗(2次)加入去離子水1mL，37℃，5min，吸除去離子水，該過程重復(fù)2次。

結(jié)果判讀根據(jù)雜交點(diǎn)顯色情況進(jìn)行結(jié)果判讀。

8.5.4.3自動(dòng)雜交儀

按芯片自動(dòng)雜交儀操作說明書進(jìn)行開機(jī)、預(yù)熱后，將包裝有膜芯片的雜交盒放入自動(dòng)雜交儀中開始

雜交過程。依次自動(dòng)完成去活化、雜交、清洗、酶孵育、顯色等雜交過程。具體測(cè)定參數(shù)見表8。

表8自動(dòng)雜交儀測(cè)定參數(shù)

程序名稱試劑名稱溫度（℃）時(shí)間（min）

去活化去活化液378

去活化清洗去活化清洗液605

雜交雜交液4245

雜交清洗雜交清洗液525

雜交清洗雜交清洗液525

酶孵育孵育液4230

孵育清洗1孵育清洗液1425

孵育清洗1孵育清洗液1425

孵育清洗2孵育清洗液2375

孵育清洗2孵育清洗液2375

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顯色顯色液3715

顯色清洗去離子水375

顯色清洗去離子水375

結(jié)果判讀根據(jù)雜交點(diǎn)顯色情況進(jìn)行結(jié)果判讀

8.6膜芯片結(jié)果判讀

8.6.1目測(cè)判讀

顯色后的膜芯片可以用肉眼直接判讀檢測(cè)結(jié)果。陽(yáng)性雜交信號(hào)為肉眼明顯可見的藍(lán)色斑點(diǎn)。如雜交

點(diǎn)部位沒有顯色，并與膜芯片背景相同，則判讀為陰性雜交信號(hào)。

8.6.2膜芯片識(shí)讀儀判讀

膜芯片顯色后，使用芯片識(shí)讀儀進(jìn)行掃描分析。如果雜交點(diǎn)部位顯色，則判讀為陽(yáng)性雜交信號(hào)。如

果雜交點(diǎn)部位沒有顯色，并與膜芯片背景相同，則判讀為陰性雜交信號(hào)。

9生物安全措施

9.1實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、設(shè)施要求及廢棄物處理應(yīng)符合GB19489的規(guī)定。

9.2生物芯片檢驗(yàn)工作應(yīng)由具備生物實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)人員承擔(dān)。

9.3檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施應(yīng)按照GB/T27403的規(guī)定執(zhí)行。

10結(jié)果判斷

10.1實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制

10.1.1基本要求

實(shí)驗(yàn)中設(shè)置10.1.2～10.1.4中所述的質(zhì)控對(duì)照，膜芯片雜交檢測(cè)結(jié)果應(yīng)符合相應(yīng)要求。如出現(xiàn)非

10.1.2～10.1.4中所述雜交結(jié)果，則判斷實(shí)驗(yàn)不成功，需重做實(shí)驗(yàn)。

10.1.2空白對(duì)照

核酸提取空白對(duì)照和多重PCR擴(kuò)增試劑空白對(duì)照均應(yīng)符合膜芯片上內(nèi)參基因探針點(diǎn)雜交信號(hào)陰性，

靶點(diǎn)基因探針點(diǎn)雜交信號(hào)陰性，陽(yáng)性對(duì)照探針點(diǎn)雜交信號(hào)陽(yáng)性，陰性對(duì)照探針點(diǎn)雜交信號(hào)陰性。

10.1.3不含動(dòng)物源成分標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照

不含動(dòng)物源成分標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照應(yīng)符合膜芯片上內(nèi)參基因探針點(diǎn)雜交信號(hào)陽(yáng)性，所有靶點(diǎn)基因探針點(diǎn)雜

交信號(hào)陰性，陽(yáng)性對(duì)照探針點(diǎn)雜交信號(hào)陽(yáng)性，陰性對(duì)照探針點(diǎn)雜交信號(hào)陰性。

10.1.4含有動(dòng)物源成分標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照

含有動(dòng)物源成分標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照應(yīng)符合膜芯片上內(nèi)參基因探針點(diǎn)雜交信號(hào)陽(yáng)性，相應(yīng)靶點(diǎn)基因探針點(diǎn)雜

交信號(hào)陽(yáng)性，陽(yáng)性對(duì)照探針點(diǎn)雜交信號(hào)陽(yáng)性，陰性對(duì)照探針點(diǎn)雜交信號(hào)陰性。

10

GB/TXXXXX—XXXX

10.2膜芯片結(jié)果判斷

10.2.1樣本檢測(cè)結(jié)果中陽(yáng)性對(duì)照探針點(diǎn)雜交信號(hào)陰性，可初步判讀膜芯片雜交過程不成功，應(yīng)確認(rèn)各雜

交試劑是否過期或保存條件不當(dāng)，更換可疑試劑后重新試驗(yàn)。

10.2.2樣本檢測(cè)結(jié)果中內(nèi)參基因探針點(diǎn)雜交信號(hào)陰性，表明未能從樣本中提取出適宜多重PCR擴(kuò)增的

核酸模板，需要重新進(jìn)行樣本核酸提取和多重PCR擴(kuò)增。

10.2.3樣本檢測(cè)結(jié)果中內(nèi)參基因探針點(diǎn)雜交信號(hào)陽(yáng)性，靶點(diǎn)基因探針點(diǎn)雜交信號(hào)陰性，表明樣本核酸提

取、多重PCR擴(kuò)增和膜芯片雜交過程正常，判斷樣本中未檢出動(dòng)物源成分。

10.2.4樣本檢測(cè)結(jié)果中內(nèi)參基因探針點(diǎn)雜交信號(hào)陽(yáng)性，靶點(diǎn)基因探針點(diǎn)雜交信號(hào)部分或全部陽(yáng)性，表明

樣本核酸提取、多重PCR擴(kuò)增和膜芯片雜交過程正常，判讀樣本中存在陽(yáng)性信號(hào)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的動(dòng)物源成分。

11確證實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物源成分膜芯片檢測(cè)陽(yáng)性樣本可進(jìn)一步進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)，確證實(shí)驗(yàn)方法按照GB/T25165、SN/T3730

中規(guī)定的方法執(zhí)行。

12結(jié)果表述

12.1未檢出

未檢出本標(biāo)準(zhǔn)所包含的動(dòng)物源成分，陰性質(zhì)控探針雜交點(diǎn)、陽(yáng)性質(zhì)控探針雜交點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果正常。

12.2檢出

檢出××××動(dòng)物源成分，陰性質(zhì)控探針雜交點(diǎn)、陽(yáng)性質(zhì)控探針雜交點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果正常。

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GB/TXXXXX—XXXX

附錄A

（規(guī)范性附錄）

膜芯片法試劑組分和存放條件

膜芯片法試劑組分和存放條件見表A.1。

表A.1膜芯片法試劑組分和存放條件

序號(hào)名稱存放條件

1多重PCR即用型預(yù)混液-20℃

2無核酸酶滅菌水-20℃

3多重PCR引物預(yù)混液-20℃

4陽(yáng)性寡核苷酸單鏈DNA(Positive-Oligo，10μmol/L)-20℃

5去活化液室溫

6去活化清洗液室溫

7雜交液室溫

8雜交清洗液室溫

9酶孵育液室溫

10堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素4℃

11孵育清洗液1室溫

12孵育清洗液2室溫

13BCIP/NBT顯色底物4℃

14膜芯片室溫

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GB/TXXXXX—XXXX

附錄B

(資料性附錄)

膜芯片法檢測(cè)流程

B.1膜芯片法檢測(cè)按照?qǐng)DB1步驟進(jìn)行。

待測(cè)樣品

核酸提取

多重PCR擴(kuò)增

膜芯片雜交

芯片結(jié)果判讀

陰性陽(yáng)性

報(bào)告結(jié)果

圖B.1膜芯片法檢測(cè)流程

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GB/TXXXXX—XXXX

附錄C

(資料性附錄)

膜芯片制作與質(zhì)量控制

C.1膜芯片制作

采用微定量噴點(diǎn)式膜芯片點(diǎn)樣儀，將各個(gè)核苷酸探針(探針終濃度25μmol/L)分布在尼龍膜芯片上

的特定位置區(qū)域。芯片表面包被的探針布局如表C.1。

內(nèi)參對(duì)照：18SrRNA，指膜芯片上用來質(zhì)控PCR擴(kuò)增過程是否正常的對(duì)照，內(nèi)參基因18SrRNA擴(kuò)

增片段互補(bǔ)的一段寡核苷酸作為探針。

陽(yáng)性對(duì)照：PC，監(jiān)測(cè)芯片雜交過程是否正常。

陰性對(duì)照：NC，指膜芯片上用來質(zhì)控探針雜交特異性的對(duì)照。一般使用一段與靶標(biāo)分子序列相近

或無關(guān)的寡核苷酸作為探針。

表C.1芯片探針布局

內(nèi)參豬黃牛羊

雞兔驢貂

狐鼠牦牛鴨

空白空白PCNC

C.2膜芯片質(zhì)量控制

膜芯片點(diǎn)樣后掃描無漏點(diǎn)、連點(diǎn)，位點(diǎn)規(guī)則，大小均勻一致，點(diǎn)與點(diǎn)的距離為300μm～500μm；雜

交后陽(yáng)性質(zhì)控實(shí)驗(yàn)雜交信號(hào)清晰可見。

_________________________________

14

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄、附錄B和附錄C為資料性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院、四川華漢三創(chuàng)生物科技公司、山東省食品藥品檢驗(yàn)研究

院、安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院、安徽出入境檢疫檢驗(yàn)局、濱州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心、成都市食品

藥品檢驗(yàn)研究院、江西省食品藥品檢驗(yàn)研究院、上海市獸藥飼料檢測(cè)所等。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：

GB/TXXXXX—XXXX

常見動(dòng)物源性成分快速測(cè)定膜芯片法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬、黃牛、羊、雞、鴨、兔、驢、貂、狐、鼠、牦牛等常見動(dòng)物源性成分膜芯片檢測(cè)

方法的原理、試樣制備與保存、試劑與儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)方法和流程、生物安全措施、結(jié)果判讀、確證實(shí)

驗(yàn)、結(jié)果表述。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于肉制品及飼料中11種常見動(dòng)物源性成分的快速和定性檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T14699.1飼料采樣

GB/T19495.1轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)通用要求和定義

GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要

GB/T19495.7轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)抽樣和制樣方法

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備

GB/T25165明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法

GB/T2