一種人類及哺乳動物細胞表達載體及其應用的制作方法專利名稱：：一種人類及哺乳動物細胞表達載體及其應用的制作方法技術領域：：本發明涉及一種人類及哺乳動物細胞表達載體及其應用，屬于基因工程技術領域：。背景技術：：基因工程(geneengineering)，又稱為重組DNA技術，是按著人們的科研或生產需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遺傳物質(DNA片段)，在體外切割，拼接形成重組DNA，然后將重組DNA與載體的遺傳物質重新組合，再將其引入到沒有該DNA的受體細胞中，進行復制和表達，生產出符合人類需要的產品或創造出生物的新性狀，并使之穩定地遺傳給下一代。按目的基因的克隆和表達系統，分為原核生物基因工程，酵母基因工程，植物基因工程和動物基因工程。基因工程具有廣泛的應用價值，為工農業生產和醫藥衛生事業開辟了新的應用途徑，也為遺傳病的診斷和治療提供了有效方法。基因工程還可應用于基因的結構，功能與作用機制的研究，有助于生命起源和生物進化等重大問題的探討。轉基因的高效表達問題是基因工程及基因治療領域人們最關心的問題之一，但由于位置效應等導致轉基因沉默、表達水平較低卻是轉基因動植物中普遍存在的一種現象。研究發現，有時通過Southernblot、RT_PCR等證實轉基因已整合到宿主的基因組中，且保留完整的拷貝，但是卻不能穩定表達或表達水平低下，有時甚至完全被抑制。這種外源基因在宿主細胞中表達受到抑制的現象稱之為轉基因沉默(transgenesilencing)，其主要原因是轉基因之間或轉基因與內源的同源基因之間存在著序列同源性的緣故。利用核基質結合區(matrixattachmentregion，MAR)是近年來發展起來的克服外源基因失活的一種有效方法。MAR序列，即核基質結合區(matrixattachmentregion,MAR)序列，亦稱核骨架結合區(scaffoldattachmentregion,SAR)序列，是真核生物染色質上可與細胞核基質結合的一段特殊DNA序列。目前已有不少利用核基質結合區提高外源基因表達的相關報道。很多實驗均已證實，MAR序列能克服外源基因沉默，提高報告基因的轉基因表達水平(見王健美，張可偉，葉文靜，等.MAR序列研究進展[J].山東農業大學學報(自然科學版)，2002，33(2)244-247.)。不同插入位點的MAR對轉基因表達的影口向不同(見ZhangJH,JingCQ,YangXJ,etal.PositionaleffectsofthematrixattachmentregionontransgeneexpressioninstablytransfectedCHOcells[J].CellBiolInt·2010,34(2):141-145.)。即使是同一MAR在不同的表達宿主中對轉基因表達的影響亦存在差異(見余惠明，王天云.β-珠蛋白MAR對轉基因在不同細胞中表達的影響[J]·第四軍醫大學學報，2005，26(14):1261-口63.)，另外研究還發現不同來源的MAR對外源基因表達的影響不一(見AllenGC，SpikerS，ThompsonWF.Useofmatrixattachmentregions(MARs)tominimizetransgenesilencing[J].PlantMolBiol,2000,43(2-3):361-376.KimJM,KimJS,ParkDH,etal.ImprovedrecombinantgeneexpressioninCHOcellsusingmatrixattachmentregions[J].JBiotechnol，2004，3107(2):95-105.BrouwerC，BruceW,MaddockS，etal.Developmentofstablecelllinesforproductionorregulatedexpressionusingmatrixattachmentregionsinmaize:adualforthemaize5'ADHlmatrixattachmentregion[J].PlantCell，2002,14(9)2251-2264.)0盡管前期有一些關于利用MAR構建的人類及哺乳動物細胞表達載體的報道，但都存在轉基因表達水平不高，載體所介導的為報告基因，載體不含多克隆位點等缺點。發明內容本發明的目的在于提供一種可高效表達目的基因的人類及哺乳動物細胞表達載體。本發明所提供的表達載體，是在pCAT3-C0ntr0l載體骨架上含有β-珠蛋白MAR序列及β-干擾素MAR序列；所述的pCAT3-Control載體骨架上，在SV40啟動子上游插入β-干擾素MAR序列，在SV40latepoly(A)region下游插入β-珠蛋白MAR序列；pCAT3-contro1上的CAT基因替換為多克隆位點，該多克隆位點是由限制性內切酶NcoI、SacI、MluI、NheI、XmaIJhoI.XbaI酶切位點所組成，所述的多克隆位點的5'、3'端分別為NcoI.XbaI酶切位點，中間為&icI、MluI、NheI、XmaI.XhoI五個酶切位點的任意排列。所述β-珠蛋白MAR序列的GenBank編號為L22754.1，β-干擾素MAR的GenBank編號為M83137.1。為方便進行真核抗性篩選，在pCAT3-C0ntr0l載體骨架上SV40Enhancer下游插入真核抗性基因選擇復合體，該復合體自上游至下游依次包括SV40早期啟動子、抗性基因以及HSV-TKpolyA；所述的SV40早期啟動子是GenBank中編號為X99274的核苷酸序列的第6850-7187位核苷酸，HV-TKpolyA是GenBank中編號為ABMM35的核苷酸序列的第3867-3885位核苷酸。所述的抗性基因的選擇是廣泛的，如Neomycin(Neo,Kan/G418耐受)、Zeomycin,Hygromycin或GFP/Neo抗性基因等，優選Neomycin抗性基因，GenBank中編號為AFl13968的核苷酸序列的第2277-3080位核苷酸。所述表達載體可按照基因工程領域的常規方法構建。本發明的另一個目的是提供一種人類及哺乳動物細胞表達載體的用途。本發明人類及哺乳動物細胞表達載體能夠顯著提高外源基因的表達，可用于制備基因治療制劑。本發明提供一種人類及哺乳動物細胞表達載體，該載體是利用pCAT3-C0ntr0l作為出發載體構建的一種表達載體。在本發明的表達載體中的多克隆位點插入目的基因，構建表達載體。本發明的表達載體能夠顯著提高所攜帶的目的基因的表達水平，比目前不含MAR及以其他方式插入MAR的表達載體可提高25倍以上。因此，針對目前基因工程領域的基因沉默現象，本發明的表達載體具有顯著提高外源基因表達的效果。圖1是pCAT3_control載體的物理圖譜；4圖2是表達載體pMAR的物理圖譜；圖3是表達載體pMAR-VEGF的物理圖譜；圖4是實施例2中各實驗組及空白對照組的VEGF蛋白表達水平的灰度比值柱形圖；1未轉化質粒的骨髓干細胞VEGF表達量；2轉化不含MAR序列表達載體VEGF表達量；3轉化表達盒兩側含有β-珠蛋白MAR表達載體VEGF表達量；4轉化本發明所述表達載體VEGF表達量。具體實施例方式下面實施例具體說明本發明所述載體的應用。特別需要指出的是，本發明說明書所舉實施例只是為了幫助理解本發明，他們不具任何限制作用，即本發明除說明書所舉實例外，還可以有其他實施方式。因此，凡是采用等同替換或等效變換形式形成的任何技術方案，均落在本發明要求的保護范圍中。本發明實施例中所使用的大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109、pCAT-3-control質粒載體，所使用的細胞系、質粒載體和試劑、工具酶均為市售商品。pCAT-3-control質粒載體購自于Promega生物公司。實施例1表達載體pMAR載體的構建(1)含β-珠蛋白MAR序列的表達載體的PCAMl構建①PCR擴增目的片段根據β-珠蛋白MAR序列(GenBank登錄號為L227M.1)，設計引物Pl和Ρ2，引物的5‘端分別引入MlI/BamHI酶切位點，引物序列如下(下劃線為酶切位點)Pl5'-GTCGTCGACAAGCTTCTGACAAATTATTCTTCC-3'；Ρ25'-AGCGGATCCGGATCCTCCCATTTCGGCCTCCTG-3'；提取人外周血基因組DNA，作為PCR擴增的模板，使用引物Pl和Ρ2擴增β-珠蛋白MAR序列，PCR反應體系如下(反應總體系為25μL):PCR艮應體系試劑濃度ftfUpl)終濃度IOxPCRbuffer231X模板DKtAIOOiigZpL1.04血PCR條件如下95°C3min，94°C40s，6056°C30s,72°C40s，每個退火溫度4個循環，最后55°C，30個循環，72°C3min。瓊脂糖凝膠電泳回收擴增產物，送生物公司測序驗證，結果表明，擴增出的DNA片段與Genbank登錄的β-珠蛋白MAR序列完全一致。②構建含β-珠蛋白MAR序列的pCAMl載體用MlI/BamHI雙酶切β-珠蛋白MAR序列的PCR擴增產物(經測序驗證正確的序列)，同時用SalI/BamHI雙酶切pCAT3_control質粒DNA，酶切體系為質粒5μL，IOXMbuffer2μL,SalI/BamHI酶各0.5μL，補足水至20μL，酶切條件為37°C，3min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結果，凝膠回收β-珠蛋白MAR序列片段和pCAT3-C0ntr0l線形質粒；酶切回收后的β-珠蛋白MAR片段及pCAT3-Control線性質粒DNA，按1:5(摩爾比)進行連接，16°C連接過夜；然后將連接產物加入到E.coliJM109菌株感受態細胞懸液中，進行轉化，將100200μL轉化后的Ε.coliJM109菌液接種在含有氨芐青霉素LB平板上，37°C培養過夜，挑取單菌落繼代培養，并進行重組質粒的雙酶切(SalI/BamHI)驗證，選取酶切驗證正確的質粒，進行測序驗證，將目的基因序列完全正確的載體命名為PCAM1。(2)含β-干擾素MAR序列的表達載體的PCAM2構建。①PCR擴增目的片段根據β-干擾素MAR序列(GenBank登錄號為Μ83137.1)，設計引物Ρ3和Ρ4，為實現定向克隆，引物的5'端分別引入Bgl11/KpnI酶切位點，引物序列如下(下劃線為酶切位占)·P35'-GTCAGACTCGAATTCAGCAAGGTCGCCACGCACA-3'；P45'-GTCGGTACCCTATCAAGATATTTAAAGAAAAAAAAAT-3'；提取人外周血基因組DNA，作為PCR擴增的模板，使用引物P3和P4擴增β-干擾素MAR序列，PCR反應體系如下PCR反應體系試劑濃度體積(μ)終濃度Taq醜5U,'pL0.5OJU/pLPCR條件如下95°C3min，94°C40s，6056°C30s,72°C40s，每個退火溫度4個循環，最后55°C，30個循環，72°C3min。瓊脂糖凝膠電泳回收擴增產物，送生物公司測序驗證，結果表明，擴增出的DNA片段與GenBank登錄的β-干擾素MAR序列完全一致。②構建含β-珠蛋白MAR序列的pCAMl載體用BglII/KpnI雙酶切β-干擾素MAR序列的PCR擴增產物(經測序驗證正確的序列)，同時用BglII/KpnI雙酶切pCAMl質粒DNA，酶切體系為質粒5μL，IOXMbuffer2yL,BglII/KpnI酶各0.5μL，補足水至20μL，酶切條件為37°C，3min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結果，凝膠回收β-干擾素MAR序列片段和pCAMl線形質粒；酶切回收后的β-干擾素MAR片段及PCAMl線形質粒DNA，按1:5(摩爾比)進行連接，16°C連接過夜；然后將連接產物加入到E.coliJM109菌株感受態細胞懸液中，進行轉化，將100200μL轉化后的Ε.coliJM109菌液接種在含有氨芐青霉素LB平板上，37°C培養過夜，挑取單菌落繼代培養，BglII/KpnI雙酶切重組質粒載體，選取酶切驗證正確的質粒，進行測序驗證，將目的基因序列完全正確的載體命名為PCAM2。(3)含neomycin真核抗性基因選擇復合體的表達載體的pCAMN構建。①PCR擴增neomycin真核抗性基因選擇復合體根據neomycin真核抗性基因選擇復合體序列(GenBank登錄號為EF437957.1)。設計引物P5和P6，引物的5'端分別引入MlI酶切位點，引物序列如下(下劃線為酶切位點)P55'-GTCGTCGACCTGTGGAATGTGTGCAGTTAGGGTGTGGA-3'；P65'-AGCGTCGACCAGACATGATAAGATACATTGATGAGA-3'；提取質粒ρ⑶NA3.1，作為PCR擴增的模板，使用引物P5和P6擴增neomycin真核抗性基因選擇復合體序列，PCR反應體系同表2，PCR條件如下95°C3min,94°C40s,6030s,72°C408，30個循環，7213min。瓊脂糖凝膠電泳回收擴增產物，送生物公司測序驗證，結果表明，擴增出的DNA片段與GenBank登錄的neomycin真核抗性基因選擇復合體序列完全一致。②構建含neomycin真核抗性基因選擇復合體的表達載體pCAMN用MlI單酶切PCR產物，酶切體系為質粒5yL，10Xbuffer2μL,SalI酶0.5μL，補足水至20μL，酶切條件為37°C，3min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結果，凝膠回收neomycin抗性基因片段(G418篩選)；同時用MlI單酶切載體pCAM2，用堿性磷酸酶處理PCAM2線性質粒；酶切回收后的neomycin抗性基因片段及經堿性磷酸酶處理過的pCAM2按15(摩爾比)用T4連接酶進行連接，16°C連接過夜；然后將連接產物加入到E.coliJM109菌株感受態細胞懸液中，進行轉化，將100200μL轉化后的Ε.coliJM109菌液接種在含有氨芐青霉素LB平板上，37°C培養過夜，挑取單菌落繼代培養，并進行重組質粒的雙酶切(SalI/BamHI)驗證，選取酶切驗證正確的質粒，進行測序驗證，將目的基因序列完全正確的載體命名為pCAMN。(4)含多克隆位點的表達載體pMAR構建①人工合成多克隆位點根據NcoI、SacI,MluI,NheI,XmaI,XhoI,XbaI的酶切位點序列，設計下列一段序列5‘-GCCAGCCCATGGGAGATCACGGCTGCTAGCCCCGGGCTCGAGTCTAGATAG-3‘，由生物公司合成。②構建含多克隆位點的表達載體pMAR用NcoIAbaI酶切人工合成的多克隆位點DNA片段，酶切pCAMN，酶切體系為質粒5μL，IOXbuffer2μL,Ncol/XbaI酶各0.5μL，補足水至20μL，酶切條件為37°C，:3min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結果，凝膠回收；將回收的多克隆位點DNA片段和pCAMN線性質粒按1:5(摩爾比)用T4連接酶進行連接，16°C連接過夜；然后將連接產物加入到E.coliJM109菌株感受態細胞懸液中，進行轉化，將100200μL轉化后的Ε.coliJM109菌液接種在含有氨芐青霉素LB平板上，37°C培養過夜，挑取單菌落繼代培養，并進行重組質粒的雙酶切(NcoIAbaI)驗證，選取酶切驗證正確的質粒，進行測序驗證，將序列完全正確的載體命名為pMAR(質粒圖譜如圖2所示)。實施例2利用本發明的表達載體在人骨髓間充質干細胞中表達VEGF基因。(1)含有血管內皮生長因子(VEGF基因)載體pMAR-VEGF的構建根據人的VEGF基因cDNA序列(GenBank登錄號為AF022375.1)設計PCR引物P7和P8，為實現定向克隆，引物的5'端分別引入NcoIAbaI酶切位點，引物序列如下(下劃線為酶切位點)P75'-GGCCCATGGATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTG-3'；P85'-GCGAAGCTTTCACCGCCTCGGCTTGTCACATCTG-3'。取胎兒心肌組織，Trizol法提取總RNA，用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。在25μL的反應體系中，分別加入dNTPlμL(10mmol/L),RNA1μg，濃度為20ymol/L的P7和P8引物各1μL，AMV-TaqDNA聚合酶1μL(5U/μL)以及AMV反轉錄酶1μL(5U/μL)，按照OneStepPCRKit(AMV)操作說明進行RT-PCR反應50°C30min，將mRNA反轉錄為cDNA；然后按如下參數94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共計30個循環。瓊脂糖凝膠電泳回收擴增產物，送生物公司測序驗證，結果表明，擴增出的DNA片段與GenBank登錄的VEGF基因cDNA序列完全一致；用Ncol/XbaI雙酶切VEGF基因的PCR擴增產物(經測序驗證正確的序列)，同時用NcoIAbaI雙酶切pAMR質粒DNA，酶切方法參考實施例1中酶切體系及條件，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結果，凝膠回收VEGF基因序列片段和pAMR線形質粒；酶切回收后的VEGF基因cDNA序列片段及pAMR線性質粒DNA按1:5(摩爾比)進行連接，16°C連接過夜；然后將連接產物加入到E.coliJM109菌株感受態細胞懸液中，進行轉化，將100200μL轉化后的Ε.coliJM109菌液接種在含有氨芐青霉素LB平板上，37°C培養過夜，挑取單菌落繼代培養，Ncol/XbaI雙酶切重組質粒載體，選取酶切驗證正確的質粒，進行測序驗證，將目的基因序列完全正確的載體命名為pMAR-VEGF(質粒圖譜如圖3所示)。(2)pMAR-VEGF轉骨髓間充質干細胞細胞