首頁>實驗材料和方法>神經元標記物神經元標記物PatimaTanapatPh.D.patimadottanapatatgmaildotcomPrinceton,NewJersey,UnitedStates譯者王秀英博士maryatlabomedotcom美國新澤西州普林斯頓合原研究有限責任公司(SynatomResearch)DOI日期更新:2013-10-19;原始版:2013-06-05引用實驗材料和方法2013;3:196簡介神經元是大腦的基本信號組件。因此，一切嘗試從整體上了解大腦是如何工作的基本組成部分都要從研究功能不同的各類型神經細胞開始。為此，免疫組化標記已逐漸成為神經科學家最有價值的工具之一。利用各種細胞組分的抗體，研究者能夠識別表達神經細胞表型的細胞，而且，就其形態特征和特定蛋白表達收集信息。在下面的章節中，將討論可以區分不同神經元細胞類型的方法。此外，由于能夠將神經元和其他類型腦細胞區分開來非常重要，也會簡要描述這些其他類型細胞。最后，免疫組織化學作為一種工具用于檢驗神經元群也會有討論，重點介紹最常用的標記，以及在選擇一個標記為一個特定的研究對象時一些關鍵的考慮因素。大腦的細胞神經元神經元由四個不同形態的部分構成：細胞體（軀干）、樹突、軸突和突觸前末梢。這些高度特化的細胞結構使它們能夠傳播電信號或動作電位，是神經元之間通信的基礎。細胞體是細胞代謝的中心。它包含含有細胞DNA的細胞核和其他細胞器。從細胞體延伸出兩種突起。第一種類型，稱為樹突，接收傳入的信號，而第二種類型，軸突，輸出傳出的信號。通常情況下，神經元有多個樹突。每個樹突反過來又都可以包含成千上萬的棘狀突起，是從其他神經元的軸突輸入信號的節點。（應該指出的是軸突也可能突觸于胞體或軸突上，盡管這種現象并不常見。）軸突從細胞體上叫做軸突丘的區域延伸出來，負責動作電位的傳播。它最終會分為幾個分支，終止于突觸。盡管突觸被說成是神經元之間的接觸點，但細胞之間并不互相接觸，而是由稱為突觸間隙的結構分隔開來。在每個軸突分支的末端是突觸前末端，其中包含充滿神經遞質的囊泡。當一個動作電位到達終端，囊泡的內容物被釋放到突觸間隙從而與突觸后細胞的進行化學通訊。神經膠質細胞除了神經元，大腦也包含另一類稱為神經膠質細胞的細胞。神經膠質細胞為神經??元提供結構和代謝支持。它們大致可分為膠質細胞和小膠質細胞兩大類。膠質細胞在生理條件下存在于發育和成年階段。膠質細胞有四大類：星形膠質細胞、少突膠質細胞、室管膜細胞、放射狀膠質細胞。星形膠質細胞支持和滋養腦細胞。它們保持了細胞外的離子平衡，為血管內皮細胞提供生化支持，并協助維持血-腦屏障。少突膠質細胞負責生成和長期維護，髓鞘能夠隔離神經軸突和幫助動作電位的傳播。室管膜細胞形成心室上皮層，包含腦脊液的空腔，以及脊髓中央管。它們也形成圍繞脈絡叢的上皮細胞層，脈絡叢也產生腦脊液，作為血液和中樞神經系統之間的界面。放射狀膠質細胞，其特點是有長的棘狀突起，能協助新的神經細胞的遷移，在中樞神經系統的類型和區域特異性分化中發揮作用，并已被確定為生成神經元和神經膠質細胞的前體[1][2]。小膠質細胞最初來源于骨髓髓系祖細胞，在介導基于細胞的中樞神經系統的免疫功能中發揮了關鍵作用，包括細胞表面抗原呈現，通過分泌各種細胞因子促進炎癥反應[3]。他們能通過吞噬清除雜質，以及分泌細胞因子改變疾病進展[4]。在發育過程中，小膠質細胞被認為在突觸重塑、細胞凋亡、吞噬細胞清除和血管生成中發揮作用[5]。在成年后，小膠質細胞被發現參與調控細胞凋亡、突觸消除、神經再生??、神經監測以及病理條件下重塑中樞神經系統的管脈系統[5][6]。這些觀察表明，小膠質細胞對于神經通路的成熟和塑造，以及這些通路調控下的神經活動是至關重要的。按照這個想法，也有人提出小膠質細胞的功能障礙可能是誘導精神和神經系統紊亂的一個原因[4]。大腦微管脈組織構成大腦微血管的內皮細胞也與我們討論的非神經元細胞相關。伴隨星形膠質細胞，這些細胞參與形成血-腦屏障（BBB）。血-腦屏障緊密調節離子、分子和細胞在血液和中樞神經系統之間運輸，為適當的神經功能以及防止損傷和疾病提供所需的環境。血腦屏障的一個主要作用是防止血液中的有毒物質進入大腦。鑒定神經細胞的類型認識到神經家族存在巨大差異的第一個人，是神經生物學的奠基人SantiagoRamonyCajal。利用高爾基銀染法，他觀察到了單個神經元高度特異的形態特征。在這樣做時，他發現，組成大腦的各種細胞在大小和形狀上都有很大差異。而一些神經元如顆粒細胞從一個小胞體的產生呈現出相對簡單的過程，其他如小腦浦肯野細胞則是非常絢麗的和復雜的。在Cajal的這一最初發現之后，科學家們已經能夠分辨數百種不同的神經細胞類型。然而，仍然缺乏一個統一的分類系統。部分原因在于不同細胞的命名往往在描述精度上各不相同。此外，神經元的類別通常有相互重疊，其結果是，一個特定的細胞類型可以有幾個不同的名字。不過，一般情況下神經元可根據一些標準，例如形態、突起模式、電生理特性和生化特性來進行分類。根據形態分類的實例（例如大小，胞體形狀和樹突狀分支型態），可以說是在科學文獻中發現的最常見的。雖然形態提供了一個明顯的和易于使用的手段，其應用的更與次原理在于它的功能意義。由于一個神經元的形狀是由它接收的輸入信號和輸出的目標共同決定的，神經元結構是細胞潛在聯系的直接反映，因此也是其功能的直接反映。舉個例子來說，攀登纖維的形狀和小腦顆粒細胞軸突的分支。這里，軸突的形狀是由連接浦肯野細胞樹突的聯系決定的，軸突分支同單一的樹突存在大量的聯系。同樣，不同的形態所揭示的信息也可通過研究典型的錐體細胞來驗證。椎體細胞的特點是一個大的、三角狀細胞體加上各種不同的錐尖和基底樹突。這種組織結構暗示其功能是將不同細胞層的輸入信號整合為一個集成的消息并傳達到另一個大腦區域[7]。用到的另一個重要的結構區分是基于一個神經元的軸突預測。那些從分離的神經群延伸出軸突從而連接的細胞成為突出或主要神經元，而只在核內有突觸連接的細胞被成為中間神經元，或固有神經元。應該強調的是，這些術語是基于軸突突起，而不是根據輸入信號的來源來命名的。因此，投射神經元可能只接收本地信號，相反固有神經元可接收從其他神經核傳來的輸入信號。鑒定這些形態的連接很重要，因為它提供了認識這些細胞功能的內在信息處理過程的基礎。實際上，這一重要概念成為近年來整理大腦內神經聯系網絡圖工作的基礎，該網絡圖被稱為的“連接組”。神經細胞類型也可通過其電生理特性得到區分。例如，新皮層神經元，其動作電位反應模式表現出顯著的差異，通常為規則峰（RS），快峰（FS）以及大爆發（IB）的細胞。RS細胞在保持刺激上適應極強，FS細胞維持高激活頻率與很少或根本沒有適??應，而IB細胞能單獨或重復生成集群尖峰[8][9]。這些細胞放電模式的多樣性是有意義的，它表明這些細胞對刺激的響應可被調節。關于迄今已有的區分標準，免疫組化可被用于提供關于細胞形態，以及在一定程度上提供的形態提供不同的神經元群的軸突突起的信息。然而，該方法在神經元表型分類上的真正能力在于它可以根據生化特性幫助區分細胞。事實上，這將在以下各節中所述，通過關聯與一個特定的神經遞質系統或一個特定的基因或蛋白質的表達來對神經元進行識別也是一個經常采用的策略。免疫組化用于鑒定神經細胞類型雖然高??爾基染色法仍然是鑒定神經細胞類型一個有用的工具，但與之相關的技術仍有一定的弊端。其中最大的弊端是，即使實驗成功了，染色結果也傾向于是可變的。雖然可以實現完全浸漬樹突樹，軸突分支和末端分支很難完全標記到[10]。此外，由于一些未知原因，浸漬作用僅能在1-10％的細胞中實現[11][12]。而這方面恰恰造成了Cajal的最初發現神經元在實際中是獨立的這一發現，它使得很難針對特定的細胞，要滿足樣本大小要求，需要的組織的量也增加了。伴隨著1970年代出現的免疫組化技術用于鑒定細胞類型，研究人員能夠規避一些老方法，如高爾基染色相關的技術問題。到那個時候，研究人員已經開始使用免疫組化來確定神經元含有單胺合成酶酪氨酸羥化酶（TH），多巴胺β-羥化酶（DBH）以及色氨酸羥化酶（TRH）[13][14][14]。然而，在運用神經元特異性烯醇化酶（NSE）和非神經元特異性烯醇化酶（NNE）分別為神經元和神經膠質細胞特異標記的報道出來后，免疫組化用來鑒定細胞的技術才開始真正蓬勃發展起來[15]。緊隨其后的是一些不同神經元類型中特異性表達的多種不同抗原標記，如NGF-介導的大外部糖蛋白（NILE-GF）[16]，膽堿乙酰基轉移酶[17]，小白蛋白[18]，神經絲蛋白[19][20]作為了標記物。雖然這些并沒有全部繼續用于這方面的研究中，但方法學上的技術的影響仍然是重要的。通常，我們用到神經元抗原的分子性質和功能特性在發現它們的時候是未知的。然而，它們仍然有用的，因為它們能夠在特定的神經元群中可靠表達。此外，采用免疫組化的優勢也很顯著。免疫組化技術上是非常容易實現的，組合免疫組化還能夠用于檢測與神經元標記共定位的多種其他功能的標記分子。最近，用于闡明神經元特性的分子生物學方法得到發展。利用轉錄調節子和位點特異性重組酶來標記特定的神經元群體的方法已經能夠被研究者使用了[21]。然而，免疫組化仍是研究神經細胞類型的主要方法，因為它相對低的成本，只需要很少的專門設備，用到的試劑也是被廣泛使用的。此外，常規顯微方法可被用來搜集數據，并根據可視化方法，免疫標記組織可被保存以供將來參考。目前，研究人員在研究中有大量的免疫組化標記物來幫助區分大腦中細胞的表型。在以下部分中，將要討論一些最常用的用來鑒定神經元和神經膠質細胞的標記物。圖1.成年大鼠C6神經元用NSE（綠色）免疫標記，以及用DAPI（藍色）復染圖。比例尺=20μm.源自[72]圖5A.神經細胞標記物神經元特異性烯醇化酶(NSE)NSE,也簡稱為γ-烯醇或烯醇化酶2，是由成熟神經元和神經元起源細胞持續表達的胞質蛋白（圖1）。它是一種腦特異性的糖酵解酶，在細胞內能量代謝中起著重要的作用[22]。在發育過程中，NSE的水平非常低，但在神經元形態和功能成熟過程中增加[23]。雖然NSE作為神經元標記物得到廣泛使用，但重要的是需要注意，它已被證明僅在特定條件下在神經膠質細胞中表達。具體來說，在培養的少突膠質細胞中檢測到的NSE活性水平、蛋白和mRNA水平與培養的神經細胞相似[24]。少突膠質細胞分化過程中其表達增加，細胞成熟后受到抑制。在病理情況下，神經膠質腫瘤和反應性膠質細胞中也能檢測到NSE[25]。神經核(NeuN)1992年，Mullen等人報道了能夠識別脊椎動物神經元特異的核蛋白單克隆抗體的產生（圖2）[26]。該蛋白被稱為神經核（NeuN），能夠在成年小鼠中樞和外周神經系統的多數神經細胞類型中檢測到。NeuN的出現暫時與神經細胞退出細胞周期和/或終末分化開始一致。該蛋白質在胚胎和成年神經細胞中，除小腦浦肯野細胞、嗅球僧帽細胞、視網膜感光細胞、黑質中的多巴胺能神經元外的其他細胞中都能夠檢測到[27][28]。圖2.小鼠大腦新皮層用NeuN標記的神經元的例子.源自[73]圖3B.盡管NeuN的免疫組化檢測已經被廣泛使用，其功能知道最近才被了解清楚。研究人員現在已經能夠將NeuN鑒定為Fox-3，Fox-3蛋白質參與調控的mRNA剪接[29]。由于Fox-3由神經系統特異性表達，人們發現它在調節神經細胞分化和神經系統發育中發揮作用[29]。微管相關蛋白2(MAP-2)MAP-2是一個神經元特異性的細胞骨架蛋白，能夠作為神經細胞的表型的標記物[30]。它在脊椎動物胚胎和成年神經系統的組織中表達。在神經前體中表達較弱，但在隨后顯著提高（大約在神經元特異性微管蛋白亞型βIII一天后表達）[31]。在大鼠的研究已表明MAP-2至少包括2a、2b和2c三個亞型。MAP-2c似乎在早期發育過程中特異性表達，只在軸突中表達。MAP-2c在成熟過程中被MAP2a所替代。與此相反，MAP2b被發現整個生命過程中都有表達。MAP-2蛋白被認為參與微管組裝，通過與中間纖絲和其他微管的交聯作用穩定微管生長。具體來說，它可能在神經發育過程中決定和穩定樹突形狀中發揮作用，因此只有在樹突軸心中能夠觀察到[32]。在一般情況下，它的表達似乎局限在神經元和反應性星形膠質細胞中[33]。?III微管蛋白(TuJ1)TuJ1是一種被認為參與神經元細胞類型特異性分化的微管蛋白[34]。微管蛋白是微管的主要結構，是細胞骨架的組成成分，在細胞結構的維護，有絲分裂，減數分裂，細胞內的運輸等等方面發揮作用。因此，免疫組化染色發現TuJ1存在于未成熟的神經元胞體，樹突，軸突和軸突末端。使用免疫組化檢測TuJ1的顯著優點之一是其展現軸突和末端細節的能力（圖3）。事實上，已經發現它在檢測細胞骨架元件受損后的變化中是有用的[35]。雖然某種β-微管蛋白的結構在膠質細胞中也有發現，但它卻并不能被TuJ1抗體識別[35]。圖3.標記細胞在成年小鼠齒狀回區用雙腎上腺皮質激素抗體標記的細胞。源自[74]圖5.雙腎上腺皮質激素(DCX)DCX在遷移神經元中廣泛表達，在神經元發育早起也能觀察到[36]。它是一種微管相關蛋白，在有絲分裂后的神經元表達，在細胞前緣的神經元突起生長中可能發揮作用[37]。與這一作用相關，DCX的免疫染色主要出現在神經突起的極端以及生長核的近側區，而在尖端并不表達。臨床上重要的神經細胞標記物值得注意的是，有一些神經細胞表型的標志物能夠引起人們特別的興趣，因為它們可用在了解臨床疾病的病理上。其中兩個是膽堿乙酰基轉移酶和酪氨酸羥化酶。膽堿乙酰轉移酶(ChAT)ChAT是催化乙酰膽堿合成的酶??。因為它在絕大多數的膽堿能神經元中表達，ChAT的免疫反應性經常被用來作為在各種神經退行性疾病中認知能力下降的標志物。它的檢測已經被用于研究阿爾茨海默氏病（AD）的典型神經性變化中，這是與基底前腦膽堿能神經元的大量損失相關的疾病。為了說明問題，驗尸報告研究已經利用ChAT免疫組化揭示認知功能受損患者的高級額葉皮層和杏仁核的纖絲密度下降和軸突靜脈瘤中[38][39]。此外，在動物模型中，免疫組化已被用于評價改變內側隔核和布羅卡區域的ChAT陽性神經元數量的實驗操作能力[40][41]。在扣帶皮層、機動區和感覺皮質、基底前腦等區域，免疫標記也被用于評價ChAT纖維網的膽堿能神經元損壞和整體形態的變化[42][43]。酪氨酸羥化酶(TH)同樣，酶TH免疫組化一直是研究帕金森氏病的一個重要工具，帕金森氏病是伴有黑質多巴胺能細胞損失的運動障礙疾病。TH能夠限制多巴胺（以及腎上腺素和去甲腎上腺素）的合成速度。在驗尸研究中，TH免疫組化已被用來量化帕金森氏癥患者的多巴胺細胞損失[44]。為了研究這種類型的損失能否通過干預得到緩解，TH免疫組化已作為檢測多種帕金森氏病的動物模型研究中保護作用的一種手段[45][46]。更多神經元標記物除了上述的標記物外，還有許多其他神經細胞相關的標記物也可以購買的到（表1）。標記物定位功能相關神經元唾液酸神經細胞黏附分子(PSA-NCAM)細胞膜神經細胞粘附分子在調節細胞形態，發育過程中細胞生長遷移中發揮作用；被認為參與成年后激活的突觸塑造[47]神經分化1(NeuroDorBeta2)細胞質和細胞核在腦中部分區域表達的轉錄因子；參與神經系統分化；是后生微神經正確分化所必需的，其缺失會導致細胞死亡[48]在不成熟的神經元中表達Tau軸突的遠端部分，在樹突中不存在*高度可溶的微管相關蛋白，相比非神經元細胞大多存在于神經元中[49];調節細胞骨架的穩定性，提供軸突的適應性[50]在中樞神經系統中豐富；在中樞神經系統的星形膠質細胞和少突細胞中也少量表達鈣結合蛋白-D28k細胞體、樹突和棘狀突起；細胞質基質鈣結合蛋白;在鈣快速緩沖中發揮作用[51]浦肯野神經元，神經內分泌細胞中表達鈣網膜蛋白細胞質基質29kDa的蛋白，與鈣結合蛋白-D28存在58%同源性；在脊椎動物中樞神經系統中表達的第一個鈣結合蛋白[52]廣泛分布于不同的神經元群體，包括皮質中間神經元神經絲蛋白(NFP)軸突神經元細胞骨架蛋白；中間纖維；為軸突提供結構支持并調節軸突的直徑[53];[22]廣泛存在與不同的神經元群體；在一些神經元中含量相對較低表1.其他常用中樞神經系統免疫組化標記物。神經膠質細胞標記物膠質纖維酸性蛋白(GFAP)毫無疑問，最廣泛使用的星形膠質細胞的標記之一是GFAP（圖4）。GFAP是一種中間絲在細胞中形成網絡，為細胞提供支持和力量。GFAP被認為可控制它們的形狀、運動和功能。在受傷的情況下（創傷或疾病），星形膠質細胞迅速增加GFAP表達[54]。最近，一些GFAP亞型已經確定[55]，包括GFAPδ，它在增生性放射狀膠質細胞以及成年后的神經干細胞中表達[56]。圖4.大鼠海馬體中用GFAP標記的細胞比例尺=15μm.源自[75]圖6D1.S100βS100β蛋白是一種由部分包圍血管的成熟星形膠質細胞以及NG2-表達細胞表達的蛋白質，被認為是少突膠質細胞和星形膠質細胞的亞群的前體[57][58]。S100β參與許多不同的功能，包括突起延長，星形膠質細胞增生，軸突增殖，抑制微管組裝[59][60]。此外，S100β蛋白已經被發現在發育過程中可作為神經營養因子，會在成年后的損傷中表達量升高[59]。波形蛋白中間絲波形蛋白是星形膠質細胞細胞骨架的組成部分。它也被放射狀神經膠質細胞表達，在發育過程中起著重要的作用。更具體地說，它被認為通過磷酸化機制組織附著，遷移和細胞信號通路相關的關鍵蛋白[61]。在的損傷的條件下，波形蛋白參與膠質細胞的激活[62]，并與反應性星形膠質細胞遷移近端局灶性損傷的部位相關[63]。在一般情況下，波形蛋白已用作神經膠質細胞的可靠標記。然而，應該指出的是，也有報道其在發育期間和神經元損害的條件下也由表達[64]。2'，3'-環核苷酸3'-磷酸二酯酶(CNPase)CNPase是一種在中樞和外周神經系統中高水平存在的酶。它幾乎只存在于少突膠質細胞（和雪旺細胞）[65]，被認為對中樞神經系統的髓鞘形成很重要[66]。CNPase出現在少突膠質細胞發育早起，與許多其他髓鞘蛋白相比，能夠成年動物的少突膠質細胞中持續表達[67]。膜結合的蛋白可以將微管蛋白連接到膜上，也可調節胞質微管的分布[68]。微血管標記物內皮屏障抗原(EBA)在一般情況下，形態特征能將微脈管內皮細胞分開。然而，微脈管系統的標記物EBA明確建立了對這些細胞鑒定的標記。與脈管系統其他標志物不同的是，EBA是正常的中樞神經系統微血管的免疫組織化學標志物，即它選擇性地在神經系統中表達。蛋白質本身位于微血管內皮細胞的質膜中。在創傷性腦損傷以及表達由于血腦屏障破壞導致血漿蛋白漏出的情況下，EBA的表達量顯著減少。目前，EBA在血-腦屏障功能中的作用尚不完全清楚。然而，研究表明，在大鼠中EBA免疫中和導致的血腦屏障破壞，表明了它在保持完整的血腦屏障中的重要性[69]。選擇一個合適的免疫組化標記物適當的神經元標記物的選擇取決于某一特定的研究目標。如果首要目標是建立一個神經細胞的表型，可用到如NEUN和MAP-2標記。對這些標記的抗體已被廣泛使用，其標記特性和分布特征已經得到了很好的研究[70][31][26][29]。雖然這兩個標記可用于需要評估神經元總數或神經元密度的研究中，但NeuN往往更傾向于是用于此目的的選擇標記。這可能是由于其緊湊的核染色模式，相比分散的樹突標記MAP-2，這可能更有利于足夠量的數據的收集。此外，由于細胞計數的應用，由緊湊模式帶來的高對比度（即信噪比）也是有幫助的。標記物蛋白序列號基因序列號文章數前三大供應商NSEP09104202611Dako(3),LifeTechnologiesCorporation(2),ThermoScientificPierceProducts(1)NeuNA6NFN31467138EMDMillipore(7),Dako(1)MAP2P11137413348Sigma-Aldrich(15),EMDMillipore(11),BDBiosciences(3)Tuj1ovance(4),EMDMillipore(1),Sigma-Aldrich(1)DCXO4360216416SantaCruzBiotechnology(5),EMDMillipore(1)GFAPako(35),Sigma-Aldrich(19),EMDMillipore(11)S100betaP04271628520Dako(10),LifeTechnologiesCorporation(2),Sigma-Aldrich(2)波形蛋白P08670743171Dako(23),Sigma-Aldrich(13),SantaCruzBiotechnology(4)CNPaseP0954312679Sigma-Aldrich(2),Abcam(1),ThermoScientificPierceProducts(1)表2.在10,113篇來邦網評估的文章中，用到神經元和神經膠質細胞的免疫組化標記物的文章數(num)。有時，一項研究可能涉及其他目標，需要滿足額外的標記要求。例如，根據某一特定的神經遞質對神經元作進一步區分時，神經遞質受體或神經遞質相關酶的抗體就可能被使用到。許多也是可用的，其中包括一些標記谷氨酸能的，GABA能的，膽堿能的或者血清胺神經元。在其他實例中，某一兼容免疫組織化學標記或其他方法的標記物可能是必要的。而這種情況在神經再生研究中經常出現，神經再生研究通常涉及聯合標記細胞檢測細胞增殖，如溴脫氧尿苷或氚標記胸苷，以及大腦區域的神經元標記。此外，根據細胞分裂的階段，這些研究一般需要那種在細胞周期中某一特定時間段表達的標記。因為蛋白的表達依賴于細胞分化的階段，標記的選擇將顯著影響需鑒定的新神經元數量。在新生細胞分化比例在組間變化的情況下，可能會用到一系列標記物來檢測神經元在分化的不同階段之間的差異。除了建立神經細胞的表型，免疫組織化學標志物可能也揭示了有關神經元的形態特征的信息。神經元特異性的抗體可用于揭示細胞結構。然而，標記是由靶蛋白在細胞內的分布決定的，在細胞核，胞體，樹突和軸突中會有所不同。因此，可以獲取的信息依賴于目標蛋白的定位。先前的研究報道了使用抗一種定位于整個樹突樹神經纖絲的抗體，該抗體進一步證實了樹突狀分支的變化[71]。這種方法有關的一個有趣發展是泛神經標記，其中包括了多種標記的組合，能夠一次性的使神經元的整個細胞結構呈現出來。技術考慮用于免疫標記分析的顯微鏡的類型可能在一定程度上決定不同標記物的可行性。亮視野顯微鏡的優點是設置簡單，對大多數研究者來說也很方便。此外，免疫標記在亮視野顯微鏡的組織處理是相對穩定的，在數據收集過程中不會淬滅。然而，亮視野顯微鏡相對于其他顯微方法在分辨率方面存在不足，對同一平面而不僅僅是重疊的樣品不能有效區分。因此，在使用這種方法時，共標記的標記物需要定位于細胞的不同區域才行。一般來說，免疫組化標記物建立共標記最好是用熒光顯微鏡來完成。除了允許在XY平面上共標記的鑒定為，這種類型的顯微鏡還能夠生成連續的圖像實現YZ平面上共標記唔的鑒定（圖5）。熒光標記最顯著的缺點是它不是永久標記的。長時間查看組織樣品會導致熒光光漂白和褪色。同樣，每通過一次共聚焦激光掃描都會導致漂白作用，因此相同的視野只能制造有限的掃描斷面。幸運的是，用最新一代的熒光染料，這已變的不是問題了。事實上，一些與強熒光染料如Alexa-488和Alexa-555共軛的神經元標記物的抗體也能夠獲得了。[放大]圖5.成年大鼠大腦中用巢蛋白（綠色）和βIII-微管蛋白（紅色）雙標記的細胞共聚焦圖像。源自[76]圖6A.另一個需要考慮的重要因素是實驗組織保存和進行分析處理的方式。根據組織標本是否被石蠟包埋和用于保存的化學固定劑的不同的，某些抗體會產生更有效的標記。供應商有時會提供針對相同抗原的不同抗體，這些抗體在某一特定實驗中的表現可能會大相徑庭。此外，研究人員也可以采用一系列的策略提高信號的信噪比，包括使用血清阻斷非特異性結合或利用過氧化氫淬滅內源過氧化物酶。組織固定中用福爾馬林或其他醛會導致蛋白質交聯，這樣抗原位點被屏蔽，造成陰性或弱免疫標記。打破這些交聯的抗原修復技術可以使用鹽酸或甲酸，熱，蛋白水解酶（蛋白酶K，胰蛋白酶，胃蛋白酶，鏈霉蛋白酶，蛋白酶），或去污劑（SDS，Triton-X）。雖然將上述因素考慮在內可以促進免疫標記實驗的成功實施，但這并不能取代在給定研究條件下重新驗證抗體特異性的需要。一種可能的策略是將免疫標記的數據與目標蛋白的mRNA原位雜交獲??得的數據進行比較?？紤]到mRNA存在于細胞體內，但目標蛋白可能會定位于細胞其他地方，因此在這種方法中，驗證的目標只能被限定為在同一細胞中對共標記的驗證。除此之外，對一種蛋白質不同抗原決定簇的抗體標記也可以用來驗證抗體的特異性。但是，證明特異性的最權威手段依然是在基因突變的動物模型中缺少標記，原本用于產生假定抗原的基因被敲除了（全局性或者組織特異性的方式均可）。多年來市售抗體的數量不斷增加，研究者已經不再需要自己開發和驗證抗體了。盡管如此，應該牢記的是抗體在高濃度或含有復雜的蛋白質混合物（如腦部分的特征）的條件下使用時，可能會與非靶抗原產生交叉反應。最終，無論抗體如何廣泛使用特性多良好，對抗體進行驗證的任務終將屬于研究者本人。參考文獻CampbellK,GotzM.Radialglia:multi-purposecellsforvertebratebraindevelopment.TrendsNeurosci.2002;25:235-8\o"NCBIpubmed11972958"PMID11972958SteindlerD.Neurogenicastrocytesandtheirglycoconjugates:notjust"glue"anymore.MethodsMolBiol.2012;814:9-22\o"NCBIpubmed22144297"PMID22144297CrossRefEglitisM,MezeyE.Hematopoieticcellsdifferentiateintobothmicrogliaandmacrogliainthebrainsofadultmice.ProcNatlAcadSciUSA.1997;94:4080-5\o"NCBIpubmed9108108"PMID9108108WakeH,MoorhouseA,MiyamotoA,NabekuraJ.Microglia:activelysurveyingandshapingneuronalcircuitstructureandfunction.TrendsNeurosci.2013;36:209-17\o"NCBIpubmed23260014"PMID23260014CrossRefEyoU,DaileyM.Microglia:keyelementsinneuraldevelopment,plasticity,andpathology.JNeuroimmunePharmacol.2013;8:494-509\o"NCBIpubmed23354784"PMID23354784CrossRefWoodleyD,ZelicksonA,BriggamanR,HamiltonT,WeissJ,EllisC,etal.Treatmentofphotoagedskinwithtopicaltretinoinincreasesepidermal-dermalanchoringfibrils.Apreliminaryreport.JAMA.1990;263:3057-9\o"NCBIpubmed2342217"PMID2342217MaslandR.Neuronalcelltypes.CurrBiol.2004;14:R497-500\o"NCBIpubmed15242626"PMID15242626MountcastleV,TalbotW,SakataH,HyvarinenJ.Corticalneuronalmechanismsinflutter-vibrationstudiedinunanesthetizedmonkeys.Neuronalperiodicityandfrequencydiscrimination.JNeurophysiol.1969;32:452-84\o"NCBIpubmed4977839"PMID4977839ConnorsB,GutnickM.Intrinsicfiringpatternsofdiverseneocorticalneurons.TrendsNeurosci.1990;13:99-104\o"NCBIpubmed1691879"PMID1691879LuoL.FlyMARCMandmouseMADM:geneticmethodsoflabelingandmanipulatingsingleneurons.BrainResRev.2007;55:220-7\o"NCBIpubmed17408568"PMID17408568ShimonoM,TsujiN.StudyoftheselectivityoftheimpregnationofneuronsbytheGolgimethod.JCompNeurol.1987;259:122-30\o"NCBIpubmed2438313"PMID2438313PasternakJ,WoolseyT.Onthe"selectivity"oftheGolgi-Coxmethod.JCompNeurol.1975;160:307-12\o"NCBIpubmed46234"PMID46234JohT,ShikimiT,PickelV,ReisD.Braintryptophanhydroxylase:purificationof,productionofantibodiesto,andcellularandultrastructurallocalizationinserotonergicneuronsofratmidbrain.ProcNatlAcadSciUSA.1975;72:3575-9\o"NCBIpubmed1059145"PMID1059145PickelV.Immunocytochemicallocalizationofneuronalantigens:tyrosinehydroxylase,substanceP,[Met5]-enkephalin.FedProc.1979;38:2374-80\o"NCBIpubmed39006"PMID39006SchmechelD,MarangosP,ZisA,BrightmanM,GoodwinF.Brainendolasesasspecificmarkersofneuronalandglialcells.Science.1978;199:313-5\o"NCBIpubmed339349"PMID339349SaltonS,Richter-LandsbergC,GreeneL,ShelanskiM.Nervegrowthfactor-induciblelargeexternal(NILE)glycoprotein:studiesofacentralandperipheralneuronalmarker.JNeurosci.1983;3:441-54\o"NCBIpubmed6338160"PMID6338160HouserC,CrawfordG,SalvaterraP,VaughnJ.Immunocytochemicallocalizationofcholineacetyltransferaseinratcerebralcortex:astudyofcholinergicneuronsandsynapses.JCompNeurol.1985;234:17-34\o"NCBIpubmed3980786"PMID3980786CelioM,HeizmannC.Calcium-bindingproteinparvalbuminasaneuronalmarker.Nature.1981;293:300-2\o"NCBIpubmed7278987"PMID7278987BoritA,BrooksT,OrdonezN,KakulasB.Centralneuralantigens:detectionanddiagnosticapplication.CritRevClinLabSci.1986;23:219-43\o"NCBIpubmed2426036"PMID2426036HayashiK,MotoiM,NoseS,HorieY,AkagiT,OgawaK,etal.Animmunohistochemicalstudyonthedistributionofglialfibrillaryacidicprotein,S-100protein,neuron-specificenolase,andneurofilamentinmedulloblastomas.ActaPatholJpn.1987;37:85-96\o"NCBIpubmed3107340"PMID3107340JefferisG,LivetJ.Sparseandcombinatorialneuronlabelling.CurrOpinNeurobiol.2012;22:101-10\o"NCBIpubmed22030345"PMID22030345CrossRefIwanagaT,TakahashiY,FujitaT.Immunohistochemistryofneuron-specificandglia-specificproteins.ArchHistolCytol.1989;52:13-24\o"NCBIpubmed2510778"PMID2510778MarangosP,SchmechelD,ParmaA,GoodwinF.Developmentalproneuron-specific(NSE)andnon-neuronal(NNE)enolase.BrainRes.1980;190:185-93\o"NCBIpubmed6769532"PMID6769532SensenbrennerM,LucasM,DeloulmeJ.Expressionoftwoneuronalmarkers,growth-associatedprotein43andneuron-specificenolase,inratglialcells.JMolMed(Berl).1997;75:653-63\o"NCBIpubmed9351704"PMID9351704VinoresS,MarangosP,BonninJ,RubinsteinL.Immunoradiometricandimmunohistochemicaldemonstrationofneuron-specificenolaseinexperimentalratgliomas.CancerRes.1984;44:2595-9\o"NCBIpubmed6722796"PMID6722796MullenR,BuckC,SmithA.NeuN,aneuronalspecificnuclearproteininvertebrates.Development.1992;116:201-11\o"NCBIpubmed1483388"PMID1483388CannonJ,GreenamyreJ.NeuNisnotareliablemarkerofdopamineneuronsinratsubstantianigra.NeurosciLett.2009;464:14-7\o"NCBIpubmed19682546"PMID19682546CrossRefKumarS,Bu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