實驗一

質粒DNA的提取及檢測實驗一質粒DNA的提取及檢測實驗一

質粒DNA的提取及檢測實驗一質粒DNA的提取及檢1質粒（plasmid）是染色體外小型（1-200kb）的共價、閉合、環狀的雙鏈DNA分子（cccDNA），能自主復制并能穩定遺傳的遺傳因子。常常編碼一些對宿主有利的酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性、產生抗生素、限制酶、修飾酶等質粒的復制：嚴緊型復制（1~n個）松弛型復制（20個以上）實驗一質粒DNA的提取及檢測質粒（plasmid）是染色體外小型（1-200kb2精品資料精品資料3你怎么稱呼老師？如果老師最后沒有總結一節課的重點的難點，你是否會認為老師的教學方法需要改進？你所經歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽曬，也不怕那風雨狂，只怕先生罵我笨，沒有學問無顏見爹娘……”“太陽當空照，花兒對我笑，小鳥說早早早……”實驗一-質粒DNA的提取及檢測-ppt課件4精品資料精品資料5常用的質粒載體是通過DNA重組技術構建而成的。pUC18,pUC19實驗一質粒DNA的提取及檢測常用的質粒載體是通過DNA重組技術構建而成的。pUC18,6質粒提取的思路質粒的特性：共價、閉合、環狀的小分子量DNA要去除的物質：

蛋白基因組DNA脂類及小分子雜質RNA實驗一質粒DNA的提取及檢測質粒提取的思路質粒的特性：共價、閉合、環狀的小分子量DNA實7第一部分質粒DNA的提取實驗一質粒DNA的提取及檢測第一部分質粒DNA的提取實驗一質粒DNA的提取及檢測8一．目的了解提取質粒的原理。學習和掌握質粒提取的方法和技術。細菌的生長和質粒的擴增菌體的收集裂解及質粒DNA的分離質粒DNA的純化實驗一質粒DNA的提取及檢測一．目的了解提取質粒的原理。實驗一質粒DNA的提取及檢測9二．原理堿變性法提取主要是利用共價閉合環狀質粒與線性染色質在拓撲學上的差異：在pH12.0-12.6堿性環境中，線性的大分子量細菌染色體DNA變性，而共價閉環質粒DNA仍為自然狀態；將pH調至中性并有高濃度鹽存在的條件下，染色體DNA之間交聯形成不溶性網狀結構，大部分DNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍為可溶狀態。通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進一步純化質粒DNA（可省略）。實驗一質粒DNA的提取及檢測二．原理堿變性法提取主要是利用共價閉合環狀質粒與線性染色質在10☆原理示意圖返回目錄

返回原理實驗一質粒DNA的提取及檢測☆原理示意圖返回目錄返回原理實驗一質粒DNA11三、實驗儀器、材料與試劑

（一）儀器：恒溫搖床、臺式離心機、高壓滅菌鍋（二）材料：含pUC18（或其他）質粒的大腸桿菌、（三）試劑： LB培養基（液體、固體）

溶液I

溶液II

溶液III

TE(pH8.0)實驗一質粒DNA的提取及檢測三、實驗儀器、材料與試劑（一）儀器：恒溫搖床、臺式離心機、12溶液I50mmol/L葡萄糖/1mg/mL溶菌酶25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895×104Pa)高壓下蒸汽滅菌15分鐘，保存于4℃。

作用：裂解細胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活實驗一質粒DNA的提取及檢測溶液I50mmol/L葡萄糖/1mg/mL溶菌酶實驗一13溶液II0.2mol/LNaOH(從5mol/L貯存液中現用稀釋)1%SDS作用：細胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和蛋白質變性。實驗一質粒DNA的提取及檢測溶液II0.2mol/LNaOH(從5mol/L貯存14溶液III5mol/L乙酸鉀 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配成的溶液中鉀的濃度為3mol/L，乙酸根的濃度為5mol/L。作用：酸性條件下質粒DNA復性，變性蛋白-SDS＋線性DNA沉淀，K＋可中和DNA實驗一質粒DNA的提取及檢測溶液III5mol/L乙酸鉀 60ml實驗一質粒D15TE(pH8.0)10mmol/LTris·Cl(pH8.0)

1mmol/LEDTA(pH8.0)RNA酶（降解RNA）作用：穩定ＤＮＡ

實驗一質粒DNA的提取及檢測TE(pH8.0)10mmol/LTris·Cl(pH16特點：小量質粒制備、最簡便、快捷應用：質粒酶切鑒定、克隆（粗提）測序、轉染（細提）質粒提取試劑盒常用方法：小量堿裂解法滿足不同需要的試劑盒純化原理：離子交換柱層析等小量制備質粒kit大量制備質粒kit去除內毒素制備質粒kit可用于大部分分生實驗實驗一質粒DNA的提取及檢測特點：小量質粒制備、最簡便、快捷質粒提取試劑盒常用方法：小量17

四、實驗步驟接含pUC18(或pET21a)質粒的單菌落于3mlLBAmp+液體培養基中

370C，190rpm振蕩培養過夜

取1.5ml菌液入1.5ml的離心管中6000rpm、離心2min，棄上清，收集菌體

100uL溶液I懸浮菌體（充分振蕩），室溫10min

加入200uL溶液II（輕輕混勻），冰上靜置5min裂解菌體實驗一質粒DNA的提取及檢測四、實驗步驟實驗一質粒DNA的提取及檢測18

加入150uL溶液III（輕輕混勻），冰上靜置15min質粒DNA復性

12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管

上清加等體積的酚：氯仿（振蕩混勻）

12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管

實驗一質粒DNA的提取及檢測實驗一質粒DNA的提取及檢測19上清加2倍體積的無水乙醇（充分混勻），冰浴30min

12000rpm，離心15min

沉淀用75%乙醇1mL洗滌兩次（輕彈混勻、離心）

12000rpm，離心10min

晾干沉淀

沉淀用20ulTE溶解沉淀法實驗一質粒DNA的提取及檢測上清加2倍體積的無水乙醇（充分混勻），冰浴30min沉淀法20吸附管用BL500ul平衡

取上清加入吸附管

5000rpm離心5min

加PW漂洗液500ul，放置2min

10000rpm離心5min，晾干

加30ulTE，10000rpm離心5min（收集到干凈的EP管中）吸附法實驗一質粒DNA的提取及檢測吸附管用BL500ul平衡吸附法實驗一質粒DNA的提取及21第二部分瓊脂糖凝膠電泳實驗一質粒DNA的提取及檢測第二部分瓊脂糖凝膠電泳實驗一質粒DNA的提取及檢測22

相關知識電泳：泳動速度決定于？瓊脂糖凝膠天然瓊脂（Agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（Agarose，約占80％）及瓊脂膠（Agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產生較強的電滲現象，加之硫酸根可與某些蛋白質作用而影響電泳速度及分離效果。瓊脂糖透明無紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳。實驗一質粒DNA的提取及檢測相關知識電泳：泳動速度決定于？實驗一質粒DNA的提取及23瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍

實驗一質粒DNA的提取及檢測瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍實驗一質粒DNA的提取24核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關系

不同構型DNA的移動速度依次為：共價閉環超螺旋DNA（cccDNA）＞直線DNA（LDNA，2條鏈發生斷裂）＞開環的雙鏈環狀DNA（ocDNA，1條鏈發生斷裂）。

實驗一質粒DNA的提取及檢測核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關系不同構型DNA的移動速度25影響遷移率的因素DNA分子的大小、瓊脂糖凝膠的濃度、DNA的構象、所加電壓（一般5V/cm）、電場方向、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成等。實驗一質粒DNA的提取及檢測影響遷移率的因素DNA分子的大小、瓊脂糖凝膠的濃度、DNA的26一、實驗目的

通過本實驗學習瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術。實驗一質粒DNA的提取及檢測一、實驗目的通過本實驗學習瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法27二、實驗原理

DNA在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。核酸為兩性分子，在pH3.5時，整個分子帶正電,pH8左右時，堿基幾乎不解離，整個分子帶負電。在堿性環境下，相同堿基數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈負電荷，能以同樣的速度向正極方向移動。具有不同的相對分子質量的DNA片段泳動速度不一樣，可進行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質量的對數值成反比關系，可以近似用于估算分子的大小。可以分離相對分子質量相同，但構型不同的DNA分子。共價閉環超螺旋DNA（cccDNA）＞直線DNA（LDNA，2條鏈發生斷裂）＞開環的雙鏈環狀DNA（ocDNA，1條鏈發生斷裂）。

實驗一質粒DNA的提取及檢測二、實驗原理DNA在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效28質粒的電泳質粒DNA的3種形式泳動速度:超螺旋>線性>開環

質粒DNA的存在形式有3種:1、共價閉環DNA:常以超螺旋形式存在2、開環DNA:質粒DNA兩條鏈中有一條發生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉從而消除張力,形成松弛的環狀分子

3、線性DNA:因質粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂而造成.開環超螺旋線性實驗一質粒DNA的提取及檢測質粒的電泳質粒DNA的3種形式泳動速度:超螺旋>線性>開環29三、儀器、材料與試劑

（一）儀器：穩流穩壓電泳儀（二）材料1.自已提取的質粒DNA2.相對分子質量標準品（三）試劑1．5×TBE儲液(pH8.0)使用時稀釋10倍，成1×TBE。2．凝膠加樣緩沖液（loadingbuffer）3.1%瓊脂糖4.10mg/ml溴化乙錠溶液（EB），4℃保存。用時稀釋成

5ug/ml的EB。實驗一質粒DNA的提取及檢測三、儀器、材料與試劑（一）儀器：穩流穩壓電泳儀實驗一30四．操作步驟瓊脂糖（1%）凝膠電泳稱取一定量瓊脂糖凝膠，按1g中100ml的量加入電泳緩沖液，微波爐中加熱約2min，使瓊脂糖溶解；溶液冷至60℃，加入EB至終濃度為0.5μg/ml，混勻，注意戴手套操作；將瓊脂糖倒入電泳板中，使凝膠厚度約為0.3-0.5cm，迅速插上梳子，檢查有無氣泡；待凝膠完全凝固后（約30min），小心取出梳子，將凝膠板置于電泳槽中，加入電泳buffer，讓液面高出膠面1mm；在DNA樣品（20ul）中加入6×loadingbuffer（4ul），混勻后用移液槍將樣品加入樣品孔中電泳，電壓100V；根據指示劑的位置，判斷是否終止電泳;在紫外燈下／凝膠成像儀上觀察電泳結果。實驗一質粒DNA的提取及檢測四．操作步驟瓊脂糖（1%）凝膠電泳實驗一質粒DNA的提取及31五、實驗結果與討論根據觀察結果，繪圖。分析自提質粒的情況。

實驗一質粒DNA的提取及檢測五、實驗結果與討論實驗一質粒DNA的提取及檢測32圖1的電泳結果不是很好，一方面上樣量太大不同構象的質粒分子沒有分開；另一方面有些樣品RNA去除得不好，在電泳結果上可以看到大團的熒光；此外還要注意上樣的技巧，上樣后稍沉降一會，使樣品均勻地分布于上樣孔的底部再開始電泳，這樣走出的條帶會較均勻。圖2的結果較好。實驗一質粒DNA的提取及檢測圖1的電