亨廷頓蛋白出核轉(zhuǎn)運機制和聚集物影響因素的研究亨廷頓舞蹈病(HuntingtonDisease,HD),一種神經(jīng)變性疾病,常染色體顯性遺傳,首先由GeorgeHuntington在1872年時報道,其臨床特征為三主征：運動異常、認(rèn)知障礙和精神異常。1993年HD致病基因成功克隆,被命名為IT15基因,正常人該基因的1號外顯子內(nèi)多態(tài)性三核苷酸[胞嘧啶-腺嘌呤-鳥嘌呤(CAG)]重復(fù)序列的重復(fù)數(shù)低于27次；當(dāng)CAG重復(fù)次數(shù)介于27到35次之間時其本人不發(fā)病,但子代的CAG重復(fù)數(shù)有可能進(jìn)一步擴增導(dǎo)致發(fā)病,尤其是在父系遺傳的情況下；介于36到39次時為不完全外顯狀態(tài),即患者可能有癥狀也可能完全無癥狀；當(dāng)CAG重復(fù)數(shù)大于40次則為完全外顯。到目前為止,還沒有任何有效的治療方法。HD具有家族性、致殘性、致死性和終生性的特點,患者多在患病后12到15年間死亡。其病理表現(xiàn)主要是細(xì)胞內(nèi)聚集物形成,該聚集物主要分布于細(xì)胞核,但也可見于神經(jīng)突起內(nèi),這可能與多聚谷氨酰胺(polyglutamine,polyQ)之間的相互作用及亨廷頓蛋白(huntingtin,htt)出核困難有關(guān)。近年來關(guān)于htt出核轉(zhuǎn)運機制的研究主要在于發(fā)現(xiàn)了羧基端的經(jīng)典的出核信號和氨基端與胞漿定位相關(guān)的氨基酸序列(cytoplasmiclocalization-relateddomain,CLRD)。htt羧基端存在一富含亮氨酸(leucine,L)的出核信號(nuclearexportsignal,NES),該序列介導(dǎo)htt通過CRM-1途徑出核。同時htt氨基端也存在一個CLRD,其介導(dǎo)htt出核不依賴于經(jīng)典出核途徑。由于htt在513、552或586氨基酸位點被半胱氨酸蛋白酶剪切,而聚集物主要由含polyQ的氨基端構(gòu)成,所以氨基端的CLRD對于htt聚集物的分布可能具有重要意義。因此我們對這段17個氨基酸構(gòu)成的CLRD進(jìn)行細(xì)致的研究：通過缺失或突變該序列的個別氨基酸,明確影響出核功能的關(guān)鍵氨基酸位點；研究該定位信號功能缺失對聚集物的影響。HD發(fā)病主要取決于CAG重復(fù)數(shù),但有研究顯示IT15基因CAG附近的CCG多態(tài)和羧基端的A2642多態(tài)也與發(fā)病相關(guān)。為了研究CCG多態(tài)與HD發(fā)病的相關(guān)性,我們對中國大陸地區(qū)的HD家系中CCG多態(tài)進(jìn)行分析,并深入研究該多態(tài)以及脯氨酸富含區(qū)對該蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和所形成的聚集物的影響。聚集物成分復(fù)雜,目前的研究結(jié)果顯示其包括p53、mdm-2、HSP70、TFIID、actin、neurofilament、syntaxin1A和核孔復(fù)合物等。對其成分的深入研究將有助于揭示它的形成和作用機制,因此,我們從已知與htt相關(guān)的蛋白質(zhì)入手對聚集物成分進(jìn)行初步探索。我們的前期工作包括以下幾個方面：1.收集了兩大HD家系,在明確其臨床、腦影像學(xué)特征的基礎(chǔ)上,完成了家系所有成員的IT15基因的突變檢測。結(jié)果顯示,在家系1中18名成員中有9名(其中5名病人,4名癥狀前患者)CAG重復(fù)數(shù)大于40次,家系2中24名成員中有5名(其中3名病人,2名癥狀前患者)CAG重復(fù)數(shù)大于50次；2.構(gòu)建了IT15基因片段pEGFP-C1-19Q(野生型)和pEGFP-C1-70Q(突變型)的真核表達(dá)載體,瞬時轉(zhuǎn)染非神經(jīng)元Hela細(xì)胞和神經(jīng)元SH-SY5Y細(xì)胞,成功構(gòu)建了HD的細(xì)胞模型；3.驗證了丁酸鈉并不抑制突變htt聚集物的形成,但能保護(hù)神經(jīng)元對抗突變htt的N端片段的毒性作用,突變htt聚集物與神經(jīng)元死亡并無必然聯(lián)系；4.缺失htt前3個氨基酸后N端片段仍具有出核功能,而缺失前5個氨基酸后其出核功能喪失,因此我們推測IT15基因的第4至17個氨基酸參與了htt蛋白N端片段的出核。第一部分亨廷頓舞蹈病致病蛋白氨基端出核序列的研究及其對聚集物的影響目的：明確htt氨基端胞漿定位相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸位點,確定該定位信號所介導(dǎo)的亞細(xì)胞定位,并觀察其對舞蹈病病理表征-聚集物的影響。方法：1.構(gòu)建前17個氨基酸、核定位信號(nuclearlocalizationsequence,NLS)與綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)的融合蛋白真核表達(dá)載體,在此基礎(chǔ)上缺失或突變個別氨基酸,構(gòu)建一系列表達(dá)載體,瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞,觀察融合蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞漿的分布,從而明確CLRD上的關(guān)鍵氨基酸位點；2.用免疫熒光染色方法對線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器的標(biāo)記物進(jìn)行染色,觀察融合蛋白的亞細(xì)胞分布；3.構(gòu)建野生型(CAG重復(fù)20次)和突變型(CAG重復(fù)59次)的1號外顯子與GFP相融合的真核表達(dá)載體,在此基礎(chǔ)上定點突變CLRD上的關(guān)鍵氨基酸位點,瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞,通過熒光顯微鏡下直接觀察和westernblot的實驗方法研究胞漿定位功能的缺失對所形成的聚集物在細(xì)胞內(nèi)的分布及其量的影響。結(jié)果：1.1-17氨基酸、NLS和GFP的融合蛋白分布在細(xì)胞漿,而NLS-GFP分布于細(xì)胞核,GFP在胞漿和胞核均勻分布,說明1-17氨基酸具有胞漿定位功能；缺失前3個氨基酸后融合蛋白仍分布于細(xì)胞漿,說明其不是該CLRD的關(guān)鍵氨基酸位點；缺失第4、第17個氨基酸后融合蛋白分布于細(xì)胞核,說明其對維持該序列的胞漿定位功能具有重要作用；將第4、第7位氨基酸由疏水氨基酸亮氨酸(leucine,L)突變?yōu)橛H水的精氨酸(arginine,R)后,融合蛋白分布于細(xì)胞核,而突變?yōu)槭杷被峒琢虬彼?methionine,M)后其仍分布于細(xì)胞漿,說明關(guān)鍵位點氨基酸的性質(zhì)對于胞漿定位具有重要意義;2.1-17氨基酸、NLS和GFP的融合蛋白與線粒體標(biāo)記物共定位,而非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等其他細(xì)胞器；3.野生型1號外顯子與GFP的融合蛋白主要分布于胞漿,而突變第4個氨基酸后該融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)呈胞漿胞核均勻分布,進(jìn)一步驗證了第4個氨基酸是介導(dǎo)胞漿定位的關(guān)鍵位點；第4個氨基酸突變導(dǎo)致突變型1號外顯子形成的核內(nèi)聚集物增多,而聚集物總量減少。結(jié)論：1.在氨基端1-17個氨基酸中前3個氨基酸的缺失對該蛋白的胞漿定位無影響；而缺失第4個或第17個氨基酸或?qū)⒌?個或第7個氨基酸由L突變?yōu)镽(由疏水氨基酸變?yōu)橛H水氨基酸)導(dǎo)致胞漿定位功能缺失,因此我們認(rèn)為CLRD的關(guān)鍵氨基酸序列為4-17氨基酸；2.氨基端CLRD介導(dǎo)蛋白定位于線粒體；3.氨基端CLRD的缺失影響形成聚集物的量和聚集物的分布：該序列功能缺失引起異常增多的CAG重復(fù)所致的聚集物總量減少而定位于核內(nèi)的比例增高。第二部分對中國大陸地區(qū)舞蹈病家系中CCG多態(tài)情況的分析及脯氨酸富含區(qū)對該蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位和聚集物形成的研究目的：完善家系收集工作,研究中國大陸地區(qū)舞蹈病家系中CCG多態(tài)與HD發(fā)病的相關(guān)性；研究包含該多態(tài)的脯氨酸富含區(qū)對htt蛋白細(xì)胞內(nèi)定位和聚集物形態(tài)和大小的影響。方法：1.家系收集工作包括：a.家系成員臨床資料的獲取;b.外周血采集后用酚氯仿法抽取DNA;c對部分家系內(nèi)的家系成員(包括患者和癥狀前患者)進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞建株；2.測序檢測CCG重復(fù)序列多態(tài),與臨床資料(包括性別比例、發(fā)病年齡、病程、家族史、臨床癥狀等)結(jié)合后行基因型表型關(guān)聯(lián)分析；3.構(gòu)建分別含CCG10和CCG7的突變體(CAG重復(fù)46次)與GFP的融合蛋白的真核表達(dá)載體,瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞,通過熒光顯微鏡和westernblot技術(shù)觀察這兩種多態(tài)對聚集物分布和量的影響；4.構(gòu)建一系列含相同CAG重復(fù)(20次)但不同CCG重復(fù)(5P、7P和9P)的GFP融合蛋白表達(dá)載體,瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察不同CCG重復(fù)對融合蛋白分布的影響；5.構(gòu)建一系列含20次和59次CAG重復(fù)的、脯氨酸片段被不同程度截短的htt蛋白與GFP融合蛋白表達(dá)載體,瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞,通過熒光顯微鏡和westernblot技術(shù)觀察脯氨酸片段對該蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和聚集物的影響。結(jié)果：1.自2002年開始我們共收集舞蹈病家系53個,其中病人60人；外周血淋巴細(xì)胞建株8人。上述家系成員的臨床資料、DNA模板和所建立的淋巴細(xì)胞株均保存完好；2.經(jīng)測序證實各真核表達(dá)載體均構(gòu)建成功；3.在所收集的53個家系中,CCG10和CCG7的分別有29個和24個(分別占了54.72%和45.28%),在56個正常對照(112條染色體)中,CCG10和CCG7分別占46.43%和35.71%,余CCG9、CCG8和CCG6分別占了10.71%、1.79%和5.36%；攜帶CCG1O和CCG7兩種多態(tài)的病人在性別比例、發(fā)病年齡、病程、家族史、臨床癥狀等方面均無統(tǒng)計學(xué)差異。4.攜帶CCG7和CCG10多態(tài)的突變體形成的聚集物在定位和數(shù)目上無顯著差異；5.當(dāng)CAG重復(fù)序列的3’端不加或加入5個CCG重復(fù)時,融合蛋白在胞漿和胞核接近均勻分布,而當(dāng)加入大于7個CCG重復(fù)時,融合蛋白分布明顯以胞漿為主,提示CCG重復(fù)數(shù)目影響其蛋白的分布；6.含20/59個CAG重復(fù)的1號外顯子與GFP的融合蛋白以胞漿分布為主,缺失羧基端的脯氨酸富含區(qū)(含2個脯氨酸片段)后則胞漿胞核彌散分布,而第一個脯氨酸片段(CCG多態(tài)存在的區(qū)域)的添加能逆轉(zhuǎn)這一趨勢。含59個CAG重復(fù)的1號外顯子與GFP的融合蛋白在核周形成大而單一的聚集物,缺失羧基端的脯氨酸富含區(qū)(含2個脯氨酸片段)后則形成多個較小且散在分布的聚集物,而第一個脯氨酸片段(CCG多態(tài)存在的區(qū)域)的添加仍能使其形成大而單一的聚集物;westernblot結(jié)果顯示缺失脯氨酸富含區(qū)后其形成的SDS不溶的聚集物顯著減少,而第一個脯氨酸片段的添加能逆轉(zhuǎn)這一趨勢。結(jié)論：1.在中國大陸地區(qū)舞蹈病家系CCG重復(fù)多態(tài)以CCG10和CCG7兩種形式為主,分別占54.72%和45.28%；2.攜帶CCG10和CCG7兩種多態(tài)的病人在臨床表型上無明顯差異,在細(xì)胞模型中這兩種多態(tài)對所形成的聚集物的量和分布無顯著影響,提示該多態(tài)在舞蹈病發(fā)病過程中不具有顯著作用；3.本實驗驗證了脯氨酸富含區(qū)對該蛋白細(xì)胞內(nèi)胞漿分布的作用,在此基礎(chǔ)上首次揭示了脯氨酸多態(tài)存在區(qū)域起了關(guān)鍵作用；而且,精確說明其中起作用的是當(dāng)脯氨酸個數(shù)達(dá)到7個時其輔助出核功能完善；4.和文獻(xiàn)報道一致,本實驗驗證了脯氨酸富含區(qū)缺失后聚集物減小、且散在存在,首次提出脯氨酸多態(tài)存在區(qū)域添加后即已逆轉(zhuǎn)了上述趨勢。第三部分聚集物內(nèi)在成分的研究目的：探究聚集物內(nèi)在成分,為闡明其形成和在HD發(fā)病過程中的作用機制提供線索。方法：將在第二部分中構(gòu)建好的突變型1號外顯子與GFP融合蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,采用免