利用RNA干擾技術沉默稻縱卷葉螟幾丁質合成酶B基因世界上有大半以上的人口將稻米作為主食,水稻作為全球最主要的糧食和經濟作物之一,病蟲害的防治一直以來都是一件至關重要的事情。稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis)主要以包括水稻在內的眾多禾本科植物葉片為食,因此也是對此類農作物危險相當嚴重的害蟲之一。幾丁質合成酶(chitinsynthase)是昆蟲體內幾丁質合成通路上至關重要的一個酶,在昆蟲生長發育周期中扮演著十分重要的角色,因此這個酶也常被科研工作者作為研究對象。本論文的主要目的是通過RT-PCR結合RACE技術克隆并分析稻縱卷葉螟幾丁質合成酶B基因(CmCHSB)的全長cDNA序列。再利用植物轉基因RNAi技術,獲得對CmCHSB具有明顯抗蟲效果的轉基因水稻植株。通過稻縱卷葉螟取食這種轉基因植株后的發育障礙和致死效應,從而達到利用安全有效的生物防治方法來防治稻縱卷葉螟。本研究的主要研究結果如下:1.稻縱卷葉螟幾丁質合成酶B基因的克隆及表達譜本研究起初運用RT-PCR方法擴增出稻縱卷葉螟開放閱讀框部分片段,然后再利用RACE-PCR技術擴增出CmCHSB的全長cDNA。然后將這兩部分所獲得的序列片段拼接得到稻縱卷葉螟幾丁質合成酶B基因全長4878bp,開放閱讀框長4578bp,共編碼1525個氨基酸。利用相關在線軟件對該酶進行生物信息學分析,結果發現該酶有17個跨膜結構域,理論等電點為5.89,無信號肽。三級空間結構分析與同源建模結果顯示,CmCHSB的三維分子空間結構中含6相同數量的α螺旋和β折疊片,均為6個,沒有發現標簽序列的存在。氨基酸序列同源性分析結果表明,CmCHSB的氨基酸序列與亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)CHSB的氨基酸序列一致性有78%,跟其他昆蟲相比同源性是最高的;與煙草天蛾(Manducasexta)和棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)CHSB的氨基酸序列一致性都達到了73%;與其他在NCBI上已經公布多種鱗翅目昆蟲CHSB的氨基酸序列一致性均保持在69%以上。基因的時空表達分析結果顯示,CmCHSB在稻縱卷葉螟整個生長發育時期以及成蟲各個組織中均發現有表達,卵期和頭部表達極低,幾乎檢測不到,成蟲時期和成蟲中腸表達最高,其表達模式高低呈現一定的規律性。2.注射dsRNA干擾稻縱卷葉螟幾丁質合成酶B基因的表達根據CmCHSB的全長cDNA序列,設計一個相應的靶標點,將其命名為CmCHSB,利用試劑盒在體外合成該基因的dsRNA。用體外顯微注射法導入正常飼養的3齡健康且活性強的幼蟲體內,以相同的方法設計維多利亞多管發光水母(Aequoreavictoria)綠色熒光蛋白(GFP)的靶標點和空白作為對照。采用體外顯微注射法將合成的dsRNA導入幼蟲體內進行飼養,通過不同處理組稻縱卷葉螟對水稻葉片額取食和取食后表型觀察結合實時熒光定量PCR(RT-qPCR)技術檢測稻縱卷葉螟體mRNA表達量探索RNA干擾效應。在分別注射CmCHSB與GFP的dsRNA48h和72h后,空白組和GFP組水稻葉片被稻縱卷葉螟取食的白條數明顯多于實驗組(注射dsRNA),兩個對照之間的白條數卻沒有明顯的差異;隨著時間的推移,兩個對照被稻縱卷葉螟取食越來越嚴重,而實驗組的取食情況變化不顯著。實驗結果顯示,在對稻縱卷葉螟進行注射實驗以后,其活性及生長發育受到很嚴重的抑制作用。在進行注射處理7d后,取出直管中存活的稻縱卷葉螟提取RNA后進行實時熒光定量檢測。RT-qPCR結果顯示,在注射dsRNA7d以后,對比于GFP和空白兩個對照,CmCHSB分別下降了18.11%和37.83%。3.重組RNA干擾植物表達載體的構建與鑒定根據稻縱卷葉螟幾丁質合成酶B基因的全長cDNA序列設計一個400bp大小的靶位點,分別將BamHI和SpeI兩個酶切位點添加到該靶標位點兩端,然后進行人工合成,經雙酶切后驗證正確后,將其與植物表達載體p1301進行連接,構建p1301-CmCHSB*重組植物表達載體。將構建的重組表達載體經PCR、雙酶切和測序鑒定,鑒定結果表明已成功構建好重組表達載體p1301-CmCHSB*,將構建好的植物表達載體采用液氮凍融法轉入農桿菌EHA105,以此構建基因工程菌。4.轉基因水稻的獲得及室內檢測用之前構建成功的農桿菌EHA105去浸染蜀恢527號秈稻愈傷組織,經愈傷組織的抗性篩選、分化和