MiR-130b通過TGF-β1通路調節自噬對糖尿病腎臟纖維化的作用和機制的研究目的:糖尿病腎病(DN)又稱糖尿病腎小球硬化癥,糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的微血管并發癥,同時也是導致糖尿病患者致死的首位原因。DN的發病機制龐雜,參與調控的通路眾多,在診斷上一般依賴尿微量白蛋白和腎臟組織活檢,缺乏有效的、穩定的、非創傷性的檢測方法。醫治上給予降血糖和血壓,僅能延緩DN的發展。而人工透析和腎臟移植治療不僅代價高昂,而且應用上有局限性。隨著對DN研究的深入,人們發現自噬與DN腎臟纖維化聯系尤為密切。另一方面,miRNA是在機體穩定存在的、擁有高度組織特異性的小分子RNA,在DN發生發展過程中作用重大。本研究旨在通過建立db/db小鼠模型和人腎小球系膜細胞的培養,對miR-130b的表達、纖維化相關蛋白以及自噬活性水平進行研究,探討miR-130b對DN的自噬與腎臟纖維化的影響,并對其靶基因進行預測,以揭示糖尿病腎病纖維化過程中的潛在機制,為DN的腎臟纖維化的預防和治療提供新方向。方法:動物實驗用db/db小鼠及C57BLKS小鼠建立糖尿病腎病模型和對照,監測各組小鼠的一般情況和指標,喂養結束后收集相應標本檢測小鼠的空腹血糖、血肌酐等,并用HE和Masson染色觀察各組小鼠腎臟組織的病理學變化,透射電鏡下觀察腎臟細胞的微結構。qRT-PCR法和Westernblotting法檢測小鼠腎臟組織纖維化和自噬相關因子的表達情況。細胞實驗方面,分別用miR-130bmimics和inhibitor及相應的對照瞬時轉染濃度為0或10ng/mlTGF-β1處理的HMC細胞,qRT-PCR法、Westernblotting法、JC-1法檢測各組腎臟及細胞的自噬及纖維化相應因子,以明確過表達或者下調miR-130b對腎臟和HMC細胞自噬和纖維化的影響,明確TGF-β1對HMC細胞自噬和纖維化的影響,明確miR-130b、TGF-β1、自噬與糖尿病腎臟纖維化之間的關系。預測miR-130b的靶基因并明確其與miR-130b的聯系。結果:db/db小鼠的空腹血糖較正常對照組明顯上升,血清肌酐明顯上升(P<0.001)。在db/db組的腎臟中可觀察到腎間質出現纖維化和基底膜變厚等病理變化。miR-130b、纖維化因子Ⅰ型膠原蛋白、FNmRNA的表達都是db/db模型組腎臟較正常對照組腎臟組織中的表達升高明顯,差異顯著,分別為(P<0.01,P<0.05,P<0.01)。WB檢測db/db模型組小鼠腎組織FN蛋白、colⅠ蛋白表達水平與正常對照組小鼠相比升高明顯,且2組間的差異很大(P<0.001,P<0.01);db/db模型組小鼠腎組織ACVR1的表達水平比正常對照組要低(P<0.01);而自噬相關蛋白Beclin1、LC3的表達是降低的(P<0.01,P<0.01),p62的表達卻高于對照組(P<0.01)。透射電鏡下db/db模型組小鼠腎小球基底膜增厚明顯。在細胞實驗方面,qRT-PCR檢測各組細胞纖維化相關因子結果顯示:高糖培養的模型組HMC細胞,其miR-130b和FN、ColⅠ的mRNA表達是高于正常對照組的(P<0.01),而miR-130b靶基因ACVR1的mRNA表達水平則低于對照組(P<0.01)。轉染miR-130bmimics組與miR-130bmimicsNC組比較,miR-130b和FN、ColⅠ的mRNA表達水平升高,ACVR1mRNA的表達明顯減弱。相反地,轉染miR-130binhibitor組與miR-130binhibitorNC組比較,miR-130b與FN、ColⅠ的mRNA表達下降,但是ACVR1mRNA的表達水平升高。而轉染miR-130bmimics+TGF組與miR-130bmNC+TGF組相比,miR-130b及其靶基因ACVR1的mRNA表達分別呈上升和下降趨勢,同時有FN、ColⅠ的表達下降。轉染miR-130binhibitor+TGF組與miR-130biNC+TGF組的比較結果顯示,前者在miR-130bFN、ColⅠmRNA表達方面比后者減少,伴隨著ACVR1mRNA表達的增強。Westernblotting結果可見:與正常對照組相比,模型組的自噬誘導蛋白Beclin1、LC3II/I的表達量都是減少的(P<0.001,P<0.001),而自噬抑制標記蛋白p62的表達量呈上升趨勢,且差異有統計學意義(P<0.001)。纖維化相關蛋白FN、ColⅠ的相對表達量是增強的,于此同時,模型組ACVR1的表達量低于正常對照組(P<0.001)。轉染miR-130bmimics組相較于其NC組,自噬相關蛋白Beclin1的表達量減少劇烈(P<0.001)、LC3II/I的表達量亦如此(P<0.001),p62蛋白的表達水平則升高(P<0.001)。伴隨著FN、ColⅠ的表達增強。轉染miR-130bmimics組靶基因ACVR1的表達量也低于其NC組(P<0.001)。而轉染miR-130binhibitor組與轉染miR-130binhibitorNC組比較,Beclin1、LC3II/I和ACVR1的表達量則是卓越上升的,p62蛋白的表達明顯下降,而纖維化增強。與miR-130bmNC+TGF組比較,miR-130bmimics+TGF組Beclin1、LC3II/I和ACVR1的表達水平下降幅度大,而p62的表達水平是升高的,伴有纖維化程度增強。與miR-iNC+TGF-β1組相比,miR-inhibitor+TGF-β1組的Beclin1的表達增強,LC3II/I和靶基因ACVR1蛋白也是如此。自噬抑制標記蛋白p62的表達水平有所下降,纖維化水平增強。JC-1線粒體膜電位檢測可見,正常對照組細胞相對于高糖模型組是升高的,說明模型組HMC細胞的線粒體自噬可能受到了抑制。而轉染miR-130bmimics組與miR-130bmimicsNC組比較,其膜電位也是相對升高的。轉染miR-130binhibitor的情況卻恰恰相反,該組細胞的線粒體膜電位是較miR-130binhibitorNC組相對下降的。結論:db/db