1DB53/TXXXX—2021滇金絲猴檢疫技術第1部分：產氣莢膜梭菌實驗室檢測技術規范重要提示：本文件涉及人獸共患病原體的操作，應在符合國家相關生物安全規定（GB19489和NY/T541）的條件下進行。本文件遵循3R原則開展動物試驗。本文件規定了滇金絲猴（Rhinopithecusbieti）檢疫技術中產氣莢膜梭菌實驗室檢測技術的總則、產氣莢膜梭菌分型、儀器設備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數據處理。本文件適用于滇金絲猴檢疫技術中產氣莢膜梭菌實驗室檢測。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求NY/T541獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規范3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1產氣莢膜梭菌Clostridiumperfringens產氣莢膜梭菌舊稱魏氏梭菌，為梭狀芽孢桿菌屬中的一種厭氧革蘭陽性桿菌，屬于條件性致病菌，主要分布于動物胃腸道，通過分泌外毒素發生致病作用。3.23R原則開展涉及實驗動物的科學研究，對實驗動物采取減少（Reduction）、優化（Refinement）和替代（Replacement）的動物福利保障措施。3.3細菌生化試驗Biochemicaltestsforbacteria根據不同種類細菌產生的酶系統及其可分解底物的種類的差異，測定代謝產物種類用來區別和鑒定細菌。3.4外毒素Exotoxin病原細菌分泌、釋放于其生存環境或動物體內的毒性蛋白質或多肽，能結合并破壞宿主細胞的正常結構與功能。2DB53/TXXXX—20213.5小鼠接種試驗Inoculationtestinmice小鼠接種試驗包括小鼠毒性試驗和毒素中和試驗，用于鑒定產氣莢膜梭菌及其外毒素類型。3.6保定Physicalrestraint采用化學或物理方式，讓動物固定保持某種姿勢或某個體位，以便于救護人員進行檢查、采樣和治療。可用麻醉藥物或鎮定劑保定，也用特制籠具、平臺、布袋、繩索以及其它方式保定。3.7TA克隆TAcloning使用TaqDNA聚合酶做PCR擴增得到的產物，憑借其DNA鏈的3?-端堿基A與質粒載體（如pMD18-T或pMD19-T）的5?-端堿基T互補配對，將PCR產物插入質粒載體。4縮略語下列縮略語適用于本文件。Amp：氨芐青霉素Ampecillinbp：堿基對BasepairBHI：腦心浸液BrainheartinfusionBLAST：基于局部序列比對算法的搜索工具BasiclocalalignmentsearchtoolddH2O：雙蒸水DoubledistilledwaterCPA：產氣莢膜梭菌α毒素ClostridiumperfringensαtoxinCPB：產氣莢膜梭菌β毒素ClostridiumperfringensβtoxinCW：魏氏梭菌ClostridiumwelchiiDNA：脫氧核糖核酸DeoxyribonucleicacidETX：ε毒素εtoxinITX：ι毒素ιtoxinPCR：聚合酶鏈式反應PolymeraseChainReactionSPS：亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶Sulfite-Polymyxin-SulphadiazineTAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸鈉Tris-Acetate-EDTATris：三羥甲基氨基甲烷Tris(hydroxymethyl)aminomethaneTSC：胰蛋白?-亞硫酸鹽-環絲氨酸Tryptose-Sulphite-Cycloserine5總則5.1培養特性：對滇金絲猴開展產氣莢膜梭菌檢測，采集新鮮的腹瀉糞便樣品，經增菌厭氧培養，轉種細菌于選擇性瓊脂培養基繼續做厭氧培養，獲得具有溶血能力、暴烈發酵含鐵牛乳特性,并在SPS或TSC瓊脂形成黑色菌落的分離菌株。5.2形態觀察：對分離菌株做革蘭染色和芽孢染色鏡檢，排除不符合產氣莢膜梭菌基本形態學特征的其他桿菌，減少得出假陽性結果的可能。5.3生化試驗：做細菌生化試驗，將符合氣莢膜梭菌生化特性的分離菌株基本確定為產氣莢膜梭菌，進一步排除非目標菌種。5.4動物試驗：取符合產氣莢膜梭菌生化特性的分離菌株，制備培養物上清濾過液，做小鼠毒性試驗和毒素中和試驗，從致病性角度對分離菌株做出產氣莢膜梭菌菌種及毒素型的常規判定。3DB53/TXXXX—20215.5分子鑒定：通過PCR擴增分析分離菌株的16SrRNA基因和4種毒素基因，得出最終鑒定結果。6產氣莢膜梭菌分型根據產氣莢膜梭菌產生的外毒素種類，傳統上將該菌分為A、B、C、D、E五個毒素型：a)A型只產生α毒素；b)B型產生α、β、ε三種毒素；c)C型產生α、β兩種毒素；d)D型產生α、ε兩種毒素；e)E型產生α、ι兩種毒素。7儀器設備和試劑7.1采樣用品7.1.1個人防護裝備：包括防護服、乳膠或聚乙烯手套、+/-N95或FFP2面罩、護目鏡、鞋套等。7.1.2樣品采集及記錄用品：包括裝有保存介質的采樣管或無菌空容器、動物檢疫器械箱、醫用棉簽、剪刀、鑷子、一次性注射器、酒精棉、碘伏棉、酒精燈、封口袋、標簽紙、記號筆、記錄表格等。7.1.3樣品暫存運輸裝備：包括保溫箱、冰盒或液氮容器、吸水填充材料、包裝膠帶、警示標識等。7.1.4樣品保存裝備：冰箱（4℃、–20℃)、液氮罐等。7.1.5保定用品：包括操作籠、防咬嘴套、眼罩和麻醉藥物（如氯胺酮注射液）或鎮靜藥物（如舒泰）。7.2實驗材料酒精棉球、厭氧試管（含硫代乙醇酸鈉等還原劑）、厭氧肉肝湯培養基（或BHI培養基）、SPS瓊脂、TSC瓊脂、CW瓊脂、含0.02%疊氮鈉的綿羊血瓊脂、梭菌增菌培養基、含鐵牛乳培養基、革蘭染色液、雪-浮（Schaeffer-Fulton）染色液；細菌生化鑒定管；TaqDNA聚合酶、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、T載體（如pMD18-T或pMD19-T）、感受態大腸桿菌細胞（DH-5α菌株）；毒素分型血清、小鼠、產氣莢膜梭菌毒素基因和16SrRNA基因特異性引物（見附錄A.1）、PCR擴增試劑（見附錄A.2）。7.3實驗設備厭氧罐（或厭氧培養箱）、低溫冰箱、–80℃冰箱、保溫箱、試管、離心管、離心機、一次性過濾器（濾膜孔徑0.22μm）、光學顯微鏡、恒溫搖床、水浴鍋、微量移液器、PCR儀、電泳儀、照膠儀。8樣品8.1采樣要求8.1.1采樣人員應為獸醫或動物保護相關的專業技術人員。8.1.2開展采樣工作前，應了解、掌握采樣區域內滇金絲猴的種群數量、活動規律、生活習性及保定方法，制定樣品采集、運輸和保存等完整的技術方案，并辦理樣品采集和運輸相關手續，確保采樣過程的科學性、安全性以及樣品的可溯源性。樣品可采集動物園或飼養基地圈養的滇金絲猴，但應得到相應主管部門的許可。4DB53/TXXXX—20218.1.3采樣安全與防護。采樣人員應規范穿戴全套個人衛生安全防護裝備做好自我防護。與樣品直接接觸的器具均應提前做滅菌處理以防樣品被污染。應準備垃圾袋帶回采樣過程中產生的所有廢棄物品，防止環境污染和造成疫病傳播。8.1.4采樣完成后，所使用的器械、容器、個人防護用品等均要進行無害化處理。8.2采樣程序8.2.1采集滇金絲猴糞便時選取新鮮（未干涸變色變形）糞便，同一堆糞便只采集一份樣品（可分裝于多只采集管），采集糞便內部部分。8.2.2采集糞便時用棉簽蘸取糞便放入對應采集管中，每采集一份樣品更換一個棉簽，并做好樣品標記和采樣記錄。記錄表包括樣品編號、采集管數、種群、采集地名、采集日期、采集人、糞樣新鮮程度、生境狀況等采樣信息。糞便樣品采集應填寫《滇金絲猴糞便樣品采集記錄表1》（見附錄B中表B.1）和《滇金絲猴糞便樣品采集記錄表2》（見附錄B中表B.2）。8.3樣品保存與運輸8.3.1糞便置于無菌的螺蓋厭氧試管或含硫代乙醇酸鈉的封口塑料袋中保存。8.3.2采集或處理的樣品在4℃條件下保存不超過24h；若長期保存，應置于–80℃冰箱。8.3.3樣品應放入預先加入冰袋的保溫箱內并及時送實驗室檢查。9試驗步驟9.1細菌分離培養及培養特性觀察9.1.1將所采每份樣品振蕩混勻，接種于厭氧肉肝湯培養基中，37℃厭氧培養18h～24h。9.1.2用接種環蘸取少量菌液涂布于SPS平板、TSC平板、CW平板和綿羊血瓊脂平板，置于厭氧罐（箱），37℃厭氧培養18h～24h；在含鐵牛乳培養基于46℃厭氧培養2h～5h，觀察細菌生長情況。9.1.3把平板上形成有明顯溶血環的單菌落挑取加入梭菌增菌培養基中厭氧培養24h，獲得分離菌株，用于進一步的鑒定。9.2革蘭染色和芽孢染色鏡檢取細菌純培養物或糞樣做革蘭染色和雪-浮染色（見附錄C鏡檢細菌個體及芽孢形態。9.3細菌生化試驗按生化鑒定管說明書操作，將9.1.3培養得到的菌液接種于分別含酪蛋白、卵磷脂酶、吲哚、脂酶、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、硝酸鹽、明膠和水楊苷的生化鑒定管，觀察細菌生長及發酵情況。9.4小鼠接種試驗9.4.1小鼠毒性試驗將產氣莢膜梭菌分離菌株接種于綿羊血平板，37℃厭氧培養24h后挑取具有典型溶血環的單菌落，轉接至厭氧肉肝湯培養基中厭氧培養14h～16h。按照5%的體積比轉接到厭氧肉肝湯培養基或BHI培養基，于43℃厭氧振蕩（250r/min）培養6h，12000r/min離心15min取上清，用0.22μm濾膜過濾，獲得外毒素。取外毒素做2倍連續稀釋，每個稀釋度接種一組實驗小鼠，5只實驗小鼠為一組，每只腹腔內注射0.3mL。對照組小鼠腹腔內注射經60℃/30min處理的濾過上清。連續觀察48h，記錄小鼠發病及死亡情況。5DB53/TXXXX—20219.4.2毒素中和試驗在滅菌試管內，用已知α、β、ε和ι毒素特異性的抗毒素（毒素分型血清分別與未經加熱處理的產氣莢膜梭菌培養物上清輕輕攪拌混合，放置于室溫孵育30min，再腹腔注射5只實驗小鼠。9.516SrRNA基因與4種毒素基因的PCR擴增及測序分析9.5.1細菌基因組DNA提取按照細菌DNA提取試劑盒說明書提取產氣莢膜梭菌基因組（包括染色體和質粒）DNA，保存于–20℃冰箱備用。9.5.2PCR擴增16SrRNA基因PCR體系見附錄A.2，擴增程序：95℃預變性5min，95℃變性30s，54℃退火30s，cpb、etx和itx）的PCR擴增程序，除退火溫度分別設置為50℃、50℃、50℃和52℃,其他9.5.3凝膠電泳檢查用天平稱取0.3g瓊脂糖，加入到100mL規格的錐形瓶中，量取30mL1×TAE加入其中，置于微波爐加熱至瓊脂糖完全融化；待瓊脂糖凝膠略降溫后加入3μL核酸染料，倒入制膠模具中，室溫靜置20min，待其完全凝固；將膠放入電泳槽內進行點樣和加入DL2000DNAMaker。加樣后進行電泳，電壓100V（8～10V/cm凝膠長度），持續時間約30min。將電泳后的凝膠放入凝膠成像儀器中，在紫外光照射下觀察條帶是否符合預期的擴增片段大小（見附錄A.1）。9.5.4TA克隆與測序分析對16SrRNA基因擴增產物符合預期大小的條帶，進行膠回收并按常規方法（見附錄D）做TA克隆，選取陽性克隆（菌落）經液體培養而成的懸液送專業機構測序。與GenBank收錄的基因序列進行在線BLAST對比以確定分離菌株的種屬地位及毒素類型。10試驗數據處理10.1細菌培養結果判定產氣莢膜梭菌在SPS平板上多為黑色菌落；在TSC平板上多為黑色菌落，周圍有一層不透明的暈圈；在CW平板上多為近圓形、微隆起、表面有皺褶、中等大小的菌落，菌落周圍有直徑為10mm～14mm的白濁環；在綿羊血瓊脂培養基上可形成直徑約2mm～5mm、表面光滑、半透明、圓頂型的菌落，菌落周圍可見雙層溶血環；在含鐵牛乳培養基出現暴烈發酵，乳凝結物破碎形成海綿樣物質。觀察到上述菌落形態，并暴烈發酵含鐵牛乳培養基，則認為分離菌株符合產氣莢膜梭菌的典型培養特性。10.2染色鏡檢結果判讀產氣莢膜梭菌兩端鈍圓，呈單個或成雙排列，偶見鏈狀；芽胞為橢圓形，雪-浮染色呈綠色，位于菌體中央或次極端，在芽孢體即內含芽孢的細菌，芽胞直徑不超過菌體寬度。鏡檢看到產生芽孢的革蘭陽性短粗大桿菌，符合產氣莢膜梭菌的形態學特征。10.3生化試驗結果判定6DB53/TXXXX—2021根據發酵管（含pH值指示劑）顏色的變化，分離菌株若不能分解利用酪蛋白、吲哚、脂酶和水楊苷，但能分解利用卵磷脂酶、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、硝酸鹽和明膠，則認為符合產氣莢膜梭菌的典型生化特性。10.4小鼠毒性試驗結果判定若接種細菌培養上清濾過液的小鼠在18h內出現死亡，而對照組未見死亡，則符合產氣莢膜梭菌毒素的典型特征。否則判為產氣莢膜梭菌毒素陰性。10.5毒素中和試驗結果判定基于抗原抗體反應的特異性，若接種經抗體處理的某型毒素的實驗小鼠不再發病死亡，便可判定毒素類型，進而根據分離菌株所產生的毒素種類確定產氣莢膜梭菌分型。10.6核酸檢測結果判定10.6.1產氣莢膜梭菌陽性判定標準除染色鏡檢見到能產生芽孢的革蘭陽性粗大桿菌，生化試驗結果與10.3描述一致，還需滿足下列3個條件之一：a)符合10.1所描述的細菌培養特性；b)毒素接種試驗結果與10.4描述一致；c)分離菌株的16SrRNA基因擴增片段與預期相符，其序列與產氣莢膜梭菌參考序列的同源性超過97%。10.6.2產氣莢膜梭菌分型標準根據毒素中和試驗（見10.5）或毒素基因PCR擴增（見9.5）的結果判定：a)僅檢測到α毒素或其基因cpa的菌株，判定為A型產氣莢膜梭菌；b)同時檢測到α、β、ε三種毒素或其基因cpa、cpb和etx的菌株，判定為B型產氣莢膜梭菌；c)同時只檢測到α、β兩種毒素或其基因cpa和cpb的菌株判定為C型產氣莢膜梭菌；d)同時只檢測到α、ε兩種毒素或其基因cpa和etx的菌株，判定為D型產氣莢膜梭菌；e)同時只檢測到α、ι兩種毒素或其基因cpa和itx的菌株，判定為E型產氣莢膜梭菌。7DB53/TXXXX—2021（規范性）引物和16SrRNA基因PCR擴增體系毒素基因引物和16SrRNA基因引物見表A.1。表A.1毒素基因引物和16SrRNA基因引物16SrRNA基因PCR擴增體系見表A.2。表A.216SrRNA基因PCR擴增體系8DB53/TXXXX—2021（規范性）采樣記錄表滇金絲猴糞便樣品采集記錄見表B.1。表B.1滇金絲猴糞便樣品采集記錄表9DB53/TXXXX—2021（規范性）革蘭染色和雪-浮染色方法C.1革蘭染色程序C.1.1取細菌懸液或菌落樣品少許做低密度涂片，風干。C.1.2用酒精燈適度加熱做物理固定。C.1.3滴加草酸銨?結晶紫溶液進行初染3min～5min，輕輕用蒸餾水洗去染料。C.1.4滴加15%盧戈