第三章沉淀與泡沫分離1第一節

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淀2什么是沉析？沉析法純化蛋白質的優點有哪些？沉析的一般操作步驟是什么？何謂鹽析？其原理是什么？鹽析操作時常用的鹽是什么？影響鹽析的主要因素有哪些？3通過本章學習應掌握以下內容有機溶劑沉析法的原理是什么？影響有機溶劑沉析的主要因素有哪些？等電點沉析的工作原理是什么？其它常用的沉析方法有哪些？4沉淀（Precipitation）：是物理環境的變化引起溶質溶解度降低，生成固體凝聚物的現象。結晶：由溶解度降低引起的固體成相現象。沉淀的純度遠低于結晶，是一種初級分離技術。但多步沉淀操作也可制備高純度的目標產物，相當于重結晶，沉淀分級目前主要用于蛋白質的分離。5常用沉淀方法的分類6一、鹽 析

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淀7（一）、原理8鹽析（Salting-out

）：蛋白質在高離子強度溶液中溶解度降低，發生沉淀的現象。Cohn經驗方程：其中：S為蛋白質的溶解度；

為常數；Ks為鹽析常數；I為離子強度；ci和Zi分別為離子i的摩爾濃度和電荷數。鹽析的機理還不十分清楚，但一般認為高離子強度使蛋白質表面雙電層變薄和水化程度降低。.β和Ks的物理意義9β—鹽濃度為0時，蛋白質溶解度的對數值。與蛋白質種類、溫度、pH值有關，與鹽無關；Ks—鹽析常數，與蛋白質和無機鹽的種類有關，

與溫度、pH值無關。Ks鹽析法：在一定pH和溫度下，改變體系離子強度進行鹽析的方法；β鹽析法：在一定離子強度下，改變pH和溫度進行鹽析；其中，Ks鹽析法由于蛋白質對離子強度的變化非常敏感，易產生共沉淀現象，因此常用于提取液的前處理。而β鹽析法由于溶質溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的純化。分子在等電點時，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶12鹽析（（NH4）2SO4）蛋白質分子表面的疏水區域，聚集了許多水分子，鹽濃度高時13，這些鹽析過程當中性鹽加入蛋白質分散體系時可能出現以下

兩種情況：“鹽溶”現象—低鹽濃度下，蛋白質溶解度增大“鹽析”現象—高鹽濃度下，蛋白質溶解度隨之下降，原因如下：無機離子與蛋白質表面電荷中和，形成離子對，部分中和了蛋白質的電性，使蛋白質分子之間的排斥力減弱，從而能夠相互靠攏；中性鹽的親水性大，使蛋白質脫去水化膜，疏水區暴露，由于疏水區的相互作用導致沉淀；14Electric

double

layer（二）、影響因素161、蛋白質的分子量和立體結構分子量越大越易鹽析，結構越不對稱越易鹽析。2、對特定的蛋白質（1）無機鹽種類（影響Ks)離子半徑小而帶電荷較多的陰離子鹽析效果較好。選擇鹽析鹽時還應考慮：a、溶解度大。b、溶解度受溫度影響較小；c、鹽溶液密度不高，利于沉淀的沉降或離心分離。d、常用的鹽析鹽是(NH4)2SO4，此外還有Na2SO4和NaCl。17鹽析用鹽的選擇18在相同離子強度下，鹽的種類對蛋白質溶解度的影響有一定差異，一般的規律為：半徑小的高價離子的鹽析作用較強，半徑大的低價離子作用較弱（Ks）磷酸鉀>硫酸鈉>硫酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂(2)溫度和pH值（影響β）19高離子強度下，溫度升高，蛋白質溶解度下降,β減小。pH值接近蛋白質pI值時，蛋白質溶解度最小。20(三)、鹽析操作(以硫酸銨為例)確定沉淀目標蛋白質所需硫酸銨飽和度的實驗步驟（設操作溫度為0℃）：取部分料液，分成等體積的幾份，冷卻至0℃；用下式計算飽和度（濃度相當于飽和濃度的百分數）達到20％~100％所需加入硫酸銨量，并在攪拌條件下分別加到料液中，繼續攪拌1h以上，同時保持溫度在0℃；其中：W為硫酸銨加入量（g/L)；S1和S2為飽和度；505為0℃時硫酸銨飽和濃度（質量百分比，g/L）；0.285為0℃時硫酸銨飽和濃度（體積百分比，L/L）。21–3000g下離心40min，將沉淀溶于2倍體積的緩沖22液中，測定其中總蛋白和目標蛋白濃度；–分別測上清液中總蛋白和目標蛋白的濃度，比較沉淀前后蛋白質是否保持物料守恒；—以上清液中總蛋白和目標蛋白濃度對飽和度作圖，從而可根據所要求達到的目標蛋白純化倍數和回收率確定硫酸銨的加入量。(四)、應用由于鹽析沉淀后產物中鹽含量較高，故一般在鹽析沉淀后，需進行脫鹽處理，才能進行后續的純化操作。23思考題24蛋白質鹽析沉淀后除鹽采取什么方法？二、等電點沉淀25等電點(pI)：蛋白質靜電荷為零時的p

H值為其等電點.利用蛋白質在pH等于其等電點的溶液中溶解度下降的原理進行沉淀分級的方法稱為等電點沉淀法（Isoelectri

precipitation）。操作條件：低離子強度；pH

pI。–低離子強度調pH值至等電點，或在等電點的pH下利用透析方法降低離子強度，使蛋白質沉淀。2627適用于疏水性大蛋白質（如酪蛋白），對于親水性強的蛋白質（如明膠）則不太適用。特點：優點：無需后續的脫鹽操作。缺點：由于操作pH過低，容易引起目標蛋白質的失活.29三、有機溶劑沉淀30定義：向蛋白質溶液中加入丙酮或乙醇

等水溶性有機溶劑，造成蛋白質分子表

面水化程度降低，從而發生沉淀的方法。例：血漿蛋白質的分離純化，至今仍用此法31常用的有機溶劑沉析劑32乙醇：沉析作用強，揮發性適中，無毒常用

于蛋白質、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更強，用量省，但毒性大，應用范圍不廣；特點：介電常數小，60%乙醇的介電常數是48丙酮的介電常數是22容易獲取當有機溶劑濃度增大時，水對蛋白質分子表面上荷電基團或親水基團的水化程度降低，因而靜電吸引力增大。33操作條件：低離子強度；等電點附近。加入有機溶劑充分攪拌，快速，蛋白質與有機溶劑接觸時間短。特點：優點：有機溶劑密度較低，易于沉淀分離；不需后續脫鹽處理；缺點：易引起蛋白質變性，須在低溫下進行。34有機溶劑沉析的特點35分辨率高；溶劑容易分離，并可回收使用；產品潔凈；容易使蛋白質等生物大分子失活；–

應注意在低溫下操作；成本高溶劑選擇36介電常數要小致變性作用要小（甲醇）毒性要小、揮發性適中水溶性要好影響有機溶劑沉析的主要因素37溫度：低溫有利于防止溶質變性；有利于提高收率（

溶解度下降）；攪拌速度：散熱溶液pH值：原則是避免目標蛋白與雜質帶有相反的電荷，防止共沉現象。（pI）離子強度:離子強度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L樣品濃度:

0.5~2%稀：溶劑用量大，回收率低，但共沉淀作用小濃：節省溶劑用量，共沉作用強，分辨率低金屬離子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+本法應用，注意下列各點：（1）降低溫度，能增加收率和減少蛋白質變性，加有機溶劑于水常為放熱反應，故操作時需冷卻。例：乙醇沉淀血漿蛋白，在

-10℃

下進行。（2）所選溶劑必須能與水互溶，而和蛋白質不起作用，常用乙醇、丙酮。38（3）蛋白質分子量越大，產生沉淀需加入的有機溶劑量越少。如用丙酮作沉淀劑有下列關系式：[所需丙酮量]=1.8-0.12[蛋白質分子量]（4）一種蛋白質溶解度會由于另一種蛋白質存在而降低。（5）沉淀的蛋白質如不能再溶解，就可能已經變性。39（6）接近等電點時，引起沉淀所需加入有機溶劑量少。（7）少量中性鹽（0.1~0.2molL-1)的存在能產生鹽溶作用，增加蛋白質在有機溶液水溶液中的溶解度，使沉淀蛋白質所需有機溶劑量增大，一般I=0.05

或稍低為最好，既能使沉淀迅速形成，又能對蛋白質起保護作用。40（8）鹽析法制蛋白質透析除鹽，進一步純化可用有機溶劑沉淀。41四、熱沉淀（Thermal

precipitation)42定義：利用在較高溫度下，熱穩定性差的蛋白質發生變性沉淀的現象，分離純化熱穩定性高的目標蛋白的方法。熱沉淀基于蛋白質的變性動力學。假設變性過程符合一級反應規律：43操作條件：調節pH；加入有機溶劑。特點：是一種變性分離法，帶有冒險性，需對目標蛋白和共存雜蛋白的熱穩定性有充分了解。44五、其他沉淀法45（一）、非離子型聚合物沉淀法46

機理不清，可能是降低蛋白質分子表面的水化程度或空間排阻作用。常用聚合物：聚乙二醇（PEG）。PEG是一種特別有用的沉淀劑，因為無毒、不可燃燒且對大多數蛋白質有保護作用。–PEG沉淀分離蛋白質的優點：1、體系溫度只須控制在室溫下。482、沉淀的顆粒較大，產物易收集。3、PEG不會使蛋白變性。PEG沉淀分離蛋白質的缺點：PEG很難從蛋白質溶液中除去，須用超濾和液-液萃取解決。PEG分子量需大于4000，最常用6000和20000。所用PEG濃度通常為20%，濃度再高會使黏度增大，造成沉淀回收困難，若

PEG對后繼分離步驟影響較小，可以不必除去。蛋白質溶解度與PEG濃度之間的關系：lgS=lgS0

-k[PEG]S:PEG存在時濃度，S0:無PEG時濃度，k:常數，與蛋白質和PEG分子大小有關。49（二）、聚電解質沉淀法50沉淀機理：與絮凝類似，在蛋白質之

間起架橋作用，同時還兼有鹽析作用。應用：主要用于酶和食品蛋白的回收常用的聚電解質：酸性多糖、海藻酸鹽、果膠酸鹽、卡拉膠和羧甲基纖維素等。聚電解質是長鏈狀結構，鏈上有許多活性51官能團，如：-COOH、NH

+等離子型基4團，通過靜電引力、范德華力、氫鍵強烈吸附膠體表面，產生架橋作用。鏈越長，活性基團越多，效果越好。（三）、金屬離子沉淀法52沉淀機理：可與蛋白質分子上的某些殘基發生作用而使蛋白質沉淀。如Ca2+和Mg2+能與羧基結合，Mn2+和Zn2+能與羧基、含氮化合物以及雜環化合物結合。–優點：可使濃度很低的蛋白質沉淀；沉淀后金屬離子可用離子交換樹脂或螯合劑除去。53第二節 泡

沫

分

離54自學思考題551、名詞解釋：鹽析和鹽溶、蛋白質的等電點、蛋白質變性。2、扼要解釋為什么大多數球狀蛋白質在溶液中具有下列性質？（1）在低pH值時沉淀。（2）當離子強度從零逐漸增加時，其溶解度開始增