半夏外植體誘導影響因素綜述Xxxx(XXXXX生命科學學院，杭州下沙，310018)摘要：半夏［PinelliaternateBriet］葉片、葉柄為外植體，用不同的方法接種于含有各種不同激素含量、微量元素含量的培養基中，進行誘導培養。對各種影響因素長生的實驗結果進行分析比較。從而了解半夏外植體誘導的最佳環境。主要研究不同植物生長素(2,4-D、IAA、NAA)，細胞分裂素(6-BA，KT)，微量元素(Mn、Fe、Zn)，以及不同的接種方式，不同年齡的外植體植株，對半夏外植體誘導產生的影響。關鍵字：半夏植物組培外植體誘導MS培養基植物激素Abstract：Theexplantsthatpinellia’sleaves,petioles,usingdifferentmethodsseededinmediumcontainingvarioushormonecontentoftraceelementcontentsintheinducedculture.Wereanalyzedandcomparedtotheexperimentalresultsofvariousfactorsaffectingthelongevity.TounderstandtheofPinelliaexplantsinducedthebestenvironment.Mainlystudythetypeofauxin(2,4-D,IAA,NAA)andcytokinin(6-BA,KT),traceelements(Mn,Fe,Zn),aswellasthetypeofinoculationmethods,ofdifferentagesexplantspLANTS,Pinelliaexplantsinduced.Keywords:PinelliaPlanttissuecultureExplantsMSmediumPhytohormone半夏(PinelliaternateBriet)是天南星科半夏屬多年生草本植物，以塊莖入藥［1］，具有潤燥化痰、降逆止嘔、消痞散結之功，為常用大宗中藥材。半夏多為野生，由于藥用和出口量大，加上大量的采挖和山區開發，使得野生資源日趨枯竭而難以滿足目前的需求。隨著災害性氣候的影響，加之人工栽培過程中多年沿用塊莖和株芽無性繁殖的方法，植株感染病毒嚴重，產量質量下降，致使半夏的栽培生產受到較大的限制，造成半夏的貯量越來越少，而國內外對半夏的需求有增無減，市場價格逐年攀升⑵。近年來，學者們對半夏的生物學特性、化學成分、炮制方法、藥用功效、引種馴化栽培技術、組織培養技術等方面進行了廣泛的研究，尤其在植物生長調節劑對半夏組織培養和植株再生快速繁苗方面做了大量研究［3-4］。還有少量對半夏組培快繁中微量元素的影響研究⑸。生長素對半夏外植體誘導的影響以MS培養基為基本培養基，單獨使用不同濃度的2,4-D、IAA、NAA三種生長素進行誘導培養，對外植體誘導的不同影響。2,4-D的誘導效應實驗證明，不同濃度2,4-D對半夏外植體的誘導效應不同。較低濃度的2,4-D有利于小塊莖及根的誘導，如某實驗⑹，當2,4-D濃度為0.2mg/L時，葉柄、葉片小塊莖的誘導率分別為100%和89.4%；當2,4-D濃度為0.5mg/L時，葉柄、葉片根的誘導率分別為80.6%和88.9%。較高濃度的2,4-D有利于愈傷組織的誘導，當濃度為1.0mg/L時誘導出淡黃色疏松愈傷組織，葉柄、葉片誘導率分別為93.3%和63.6%.當2,4-D濃度升高到2.0mg/L時，愈傷組織再分化形成粗短并帶有絨毛。IAA的誘導效應IA對半夏塊莖的誘導率較高，大部分塊莖外植體先脫分化成白色帶突起狀的胚性愈傷組織，突起的上端逐漸變綠長成小塊莖，并產生細長根。比較適合用于半夏的無性快繁，濃度0.5/L的效果較好，小塊莖誘導率為67.6%。高濃度的IAA較有利于根的誘導和愈傷組織的形成，抑制塊莖的分化⑺。NAA的誘導效應NAA可促進塊莖和根的大量形成，當濃度0.2m/L時，葉片、葉柄的小塊莖誘導率分別為94.5%和96.0%,根的誘導率分別為90.9%和96.0%。隨著NAA濃度的增高，小塊莖和根的誘導率逐漸降低，而愈傷組織誘導率升高。當NAA濃度為2.0m/L時，葉片和葉柄的愈傷組織誘導率分別為91.0%和36.0%。說明低濃度的NAA利于根的分化和苗的形成。1.4小結低濃度的生長素均有利于小塊莖的產生和根的形成。當214-D、IAA、NAA濃度為0.2mg/L時，均有大量小塊莖產生,不同生長素誘導的小塊莖產生的植株的形態不同。2,4-誘導時，根數量較少，被絨毛；IAA誘導時，根數目較少，生長較慢；NAA誘導時，根細長，數量多，且葉柄粗壯。分裂素對半夏外植體誘導的影響以MS培養基為基本培養基，單獨使用不同濃度的6-BA,KT,ZT三種分裂素進行誘導培養，對外植體誘導的不同影響。6-BA的誘導效應較低濃度6-BA有利于小塊莖的誘導。當6-BA濃度為0.2-0.5mg/L時，葉柄、葉片小塊莖誘導率分別94.1%-100%和96.0%-100%，當濃度為1.0mg/L時，葉柄的小塊莖誘導率為73.3%；隨著濃度的升高，在葉片邊緣和葉柄的兩端產生生綠色的愈傷組織，且生長分化緩慢。當濃度為2.0mg/L時，葉片愈傷組織的誘導率為70.0%。KT的誘導效應當KT濃度為0.2mg/L時，葉柄和葉片的小塊莖誘導率分別為80.7%和35.3%,生根率分別為75.0%和9.8%，說明較低濃度的KT有利于葉柄進行植株再生。當濃度增高時，葉柄產生愈傷組織，當濃度為2.0mg/L時，葉柄和葉片的小塊莖誘導率生根率分別83.0%和58.0%、62.3%和32.0%，葉柄愈傷組織的誘導率為50.9%，葉片未見愈傷組織產生。ZT的誘導效應0.2-0.5mg/L的ZT對半夏外植體小塊莖誘導率分別為73.8%和80.0%，但隨著濃度的升高生根率和愈傷組織誘導率都有所增加，葉柄外植體根的誘導率由19.0%增加為64.5%，愈傷組織誘導率由11.9%增至16.7%。當ZT濃度繼續升高時，根的誘導率降低，而愈傷組織誘導率提高。當濃度為1.0mg/L時葉柄和葉片生根率分別為46.7%和34.0%,愈傷組織的誘導率分別為25.0%和10.0%；當濃度為2.0mg/L時葉柄和葉片的生根率分別為2.2%和37.3%，愈傷組織的誘導率分別為48.9%和29.4%。2.4小結低濃度的細胞分裂素均有利于植株的再生，且生長勢比單因素低濃度的生長素處理長勢好，外植體先在邊緣產生綠色突起，再由綠色突起分化為大量的小塊莖，6-BA效果較好，但葉較小；KT誘導的小塊莖萌發的植株葉柄較細，葉片較大。不同濃度的激素搭配也會有不同的影響，以半夏頂芽為外植體誘導愈傷組織，在接種3-5d后，頂芽兩端向上蹺起，隨后有切口的一端膨大。接種10-12d后，可見頂芽有所增長，其切口端出現白色絨毛狀物。第15天后，漸漸出現淡黃或透明的松散型愈傷組織。將愈傷組織切下于同樣的培養基中進行增殖培養。出愈率可以看出，當NAA濃度相同時，6-BA濃度越大，愈傷組織出愈率越高；當6-BA濃度相同時，NAA為0.2mg/L時，出愈率普遍較高，且試驗中觀察到6-BA與NAA組合較2,4-D與KT組合的愈傷組織更接近胚性愈傷組織。經過差異顯著性分析表明，各處理間的出愈率差異顯著，其中出愈率最高的為6-BA2.0mg/L和NAA0.2mg/L為半夏頂芽愈傷組織誘導的最適宜激素濃度。微量元素對半夏外植體誘導的影響在相同誘導培養基中添加不同濃度的Mn、Fe、Zn，以葉片、葉柄和塊莖為外植體，研究微量元素對半夏外植體直接誘導形成小塊莖的影響。在培養32d后，葉柄在不同培養基上的誘導及分化生長狀況不一；不同培養基組合中葉柄誘導率及分化率也不同。通過試驗觀察統計,不同處理組合對葉柄誘導率在一定范圍內影響不很顯著，而對葉柄分化率影響很顯著。其分化率高可達到74.1%，對照52.8%,且培養基所誘導的愈傷組織為綠色致密的愈傷組織，具有很強的生活力，分化苗生長健壯。其次的培養基，其葉柄兩端形成帶綠色芽點的愈傷組織，生長健壯。因此，用半夏葉柄作為外植體培養首選錳5.5mg/L,鐵7.5mg/L,鋅1.0mg/L的培養基，其他的幾種培養基培養葉柄后大部分形成白色疏松、或淺黃色水浸狀的非胚性愈傷組織，能分化成苗的芽點少，有些培養基培養，葉柄被誘導后不能分化成叢生芽或苗，最后褐化死亡。微量元素作為植物生長必需的營養元素，雖然含量較少，但在代謝過程中與大量元素一樣具有很重要的功能。錳是許多酶的活化劑；鐵硫蛋白參與氧化還原反應，鐵的電子得失在呼吸過程中有非常重要的功能；鋅是生長素前身色氨酸合成所必需，缺鋅植株內吲哚和絲氨酸不能合成色氨酸，因而不能合成生長素，植物生長受阻⑻。該研究通過對半夏外植體不同部位的培養試驗，找到最佳的微量元素組合配方。結果表明：培養葉片葉柄的最佳微量元素濃度水平是：Mn5.5mg/L、Fe為9.5mg/L、Zn為2.0mg/L,培養小塊莖的最佳微量元素濃度水平是：Mn7.5mg/L、Fe9.5mg/L、Zn為1.0mg/L。對不同的外植體部位進行組織培養，其所需的微量元素濃度組合不同。根據培養需求，使用相應的培養基組合，這樣可以進一步提高半夏試管塊莖的誘導分化率，為半夏試管塊莖的規?；a提供技術支持。其他因素對半夏外植體誘導的影響4.1苗齡對外植體誘導的影響在影響半夏出芽的外界因素中，外植體的年齡對植株再生有重要影響9，無菌苗苗齡低，約為10d時，葉片的分化率僅為40%，葉柄分化率達50%，而塊莖的分化率最高，可達94%,且接種過程中容易造成機械損傷，使傷口褐化，導致外植體死亡。苗齡過高，如苗齡為45d以上時，葉片和葉柄分化率近于0，塊莖的分化率為58%。易形成倒苗，葉片和葉柄老化甚至枯萎，不能用做外植體，生長旺盛期和珠芽成熟期的半夏材料，其外植體的分化率都較高；倒苗期，外植體材料減少，不利于快繁和研究。4.2外植體放置方式對誘導的影響外植體的放置方式對出芽有很大的影響。塊莖垂直放置出苗率高，出芽率達82%，水平放置出芽率達40%。葉柄和葉片平放于培養基效果較好，出芽率分別為52%和70%;葉柄垂直插入培養基，出芽低，僅有20%，且出芽速度慢。4.2培養條件對誘導的影響培養條件是半夏離體培養的重要環節，最佳培養溫度18-20°C，溫度過低，誘導時間延長，誘導率下降；溫度過高時，切塊容易變黑，若形成愈傷組織其顏色呈淡黃色，容易老化，分化成苗率低。在分化出苗期，光的作用比較明顯，光照時間應較長［10］?？偨Y展望植物組織培養作為一項重要的生物技術存在無限的潛力和市場開發價值。半夏的組織培養也還有不少問題需要更進一步探討研究EM。6.1半夏組織培養條件的完善對于半夏最佳外植體的選擇，不同的學者研究的結果有所差異，甚至差異很大，產生的原因可能跟不同學者研究的半夏品種、所選培養基、添加的生長調節物質以及當時培養的外界條件等不同可能有關。植物的生長調節物質特別是生長素類和細胞分裂素類已證實對半夏組織培養有至關重要的作用。但對于愈傷組織的誘導、增殖、器官的分化等最適配比的報道，不同的學者研究的結果也不相一致。所以我們在以后的半夏組培研究中要把品種、培養基、激素、外界條件、實驗目的等因素都考慮進來，這樣才能更有利于對半夏的組織培養研究。6.2建立和完善半夏的快速繁殖體系利用半夏的組織培養進行快速繁殖，可以一次性獲得再生苗。但要想滿足市場需求，必須建立半夏的無性系快速繁殖體系。目前這方面的研究雖有報道，但在愈傷組織繼代增殖培養過程中，會造成一些遺傳變異，改變試管苗的品質。因此要不斷的完善和優化相關技術條件。6.3半夏人工種子的研發半夏人工種子的研制成功給半夏的快速繁殖與育種開辟了一個新的領域。目前半夏人工種子的研究也取得了一定的成果，但用小塊莖作為人工種子的制作材料對于人工種子的規模生產十分有限，因而應考慮對半夏進行細胞懸浮培養，以獲得大量胚狀體。進而使半夏人工種子能達到工業化生產的要求。另外用海藻酸鈉作為包埋系統保水性差，營養物質易滲漏，也極易染菌，因此難以實際應用，故應選擇更適合的材料作為人工種子的種皮，目前，復合型包埋基質是人工種皮材料的發展發向。參考文獻：羅廣明.半夏的快速繁殖研究[J].中藥材,2003(10):26.薛建平，張愛民,盛瑋等.鉀鹽對試管塊莖誘導的影響[J].中國中雜志,2006(7):546-548.夏海武，戰克勤,趙月玲.半夏組織培養研究[J].中國中藥雜志，1994,19(12):720-721.羅光明，劉賢旺，姚振生等.半夏的組織培養和植株再生[J].江西中醫學院學報,2000,12(3):125-126.魏莉霞.微量元素對半夏組織培養誘導率及分化率的影響[J].北方園藝,2009,8.254-256王前,王玨,陸遠,谷金科,王俊麗,楊林.不同激素及濃度