1斑馬魚飼育技術條件本文件規定了《斑馬魚飼育技術條件》的飼育魚房工藝布局、飼育設施、飼育環境條件、飼育密度與餌料及飼喂、繁育和遺傳資源保存、倫理維護以及質量規范。本文件適用于斑馬魚的飼育。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB5749生活飲用水衛生標準GB/T18883室內空氣質量標準GB/T31962污水排入城鎮下水道水質標準3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1斑馬魚胚胎zebrafishembryo未出殼膜的斑馬魚胚胎，一般指0dpf~3dpf（dayspostfertilization；受精后天數）的斑馬魚胚胎。3.2斑馬魚仔魚zebrafishlarva出殼膜后至發育到未成為幼魚之前的斑馬魚，一般指4dpf~28dpf的斑馬魚。3.3斑馬魚幼魚juvenilezebrafish外部形態與成魚相似但未性成熟的斑馬魚，一般指29dpf~84dpf的斑馬魚。3.4成年斑馬魚adultzebrafish性成熟、具備繁殖能力的斑馬魚。一般指年齡大于84dpf的斑馬魚。4飼育魚房工藝布局4.1飼育魚房總體要求獨立空間，凈高度不宜低于250cm；地面防潮、防水、防滑、耐沖擊、平整；墻壁光滑、耐潮、不吸水、抗擊碰性損壞、無縫隙。24.2飼育魚房功能分區包括去離子水制備區、循環系統流水處理區、飼育區、餌料生產區、儲存區、清潔區、隔離區和實驗區。4.2.1去離子水制備區將符合GB5749《生活飲用水衛生標準》要求的水進行反滲處理制備成去離子水的區域，可位于飼育魚房外獨立空間。4.2.2循環系統流水處理區對飼育用水進行過濾、紫外消毒、充氣、pH調節和電導率調節等集中區，可獨立于飼育魚房外。4.2.3飼育區日常繁育斑馬魚的飼育區應配備流水飼育設施飼育仔魚、幼魚與成年魚；配備靜水飼育設施飼育胚胎、仔魚以及用于親魚繁育。4.2.4餌料生產區包括培育開口餌料草履蟲的草履蟲生產區和孵化豐年蟲幼蟲的豐年蟲卵孵化區。分別配置供培育草履蟲的容器和供孵化豐年蟲卵的專用孵化設備。4.2.5儲存區配備冰箱存放斑馬魚餌料。4.2.6清潔區設有清潔用水池以及魚撈等漁具存放區。4.2.7隔離區外來的斑馬魚應飼養在獨立于日常繁育飼育區之外的隔離區，胚胎經消毒處理后方可進入日常繁育飼育區。4.2.8實驗區4.2.8.1進行實驗處理的斑馬魚應飼育在獨立于斑馬魚日常繁育飼育區外的實驗區，可位于飼育魚房外的實驗室內。4.2.8.2僅為完成遺傳改造而實施過顯微注射的斑馬魚胚胎或僅用于簡單顯微形態學觀測以評估質量的斑馬魚可回到日常繁育飼育區。4.2.8.3所有經實驗處理的斑馬魚（包括胚胎、仔魚、幼魚和成魚）不應回到日常繁育飼育區。完成實驗后通常需要進行安樂死。5飼育設施5.1流水飼育系統5.1.1飼育架3應由不銹鋼或其它防水防銹等無毒材料制成，層距不低于35cm。5.1.2飼育缸5.1.2.1材質要求無毒、無害、無放射性、耐腐蝕、耐高溫、耐高壓、耐沖擊、易清洗、易消毒滅5.1.2.2飼育缸由飼育蓋板、飼育缸體以及飼育后插板組成。5.1.2.3飼育蓋板設餌料投喂孔、流水單管孔和備用孔。5.1.2.4飼育缸體配有雙卡槽，可同時插入防仔魚和幼魚逃逸后插板以及導污后插板。5.1.3循環凈化設備包括過濾處理單元、水體循環設備、消毒單元、充氣補氧單元、PLC自動化控制集成單元、給排水分配單元、生物凈化水槽、系統流量監控單元、pH控制單元和電導率控制單元。5.2靜水飼育系統5.2.1飼育架同5.1.1。5.2.2交配缸內外膽結構，材料要求與飼育缸（5.1.2）一致；內膽底部高于外盒底部2cm，并配有分離隔板和蓋板。5.2.3飼育缸同5.2.2，但無內膽和分離隔板。6飼育環境條件6.1溫度室溫23℃~30℃,24h內變動不超過2.5℃。水溫25℃~29℃,24h內變動不超過1.0℃。6.2濕度相對濕度為45%~70%。6.3空氣空氣質量符合GB/T18883《室內空氣質量標準》。另需有新風輸入，至少每4h~5h輸入1次，每次空氣交換量是整體空間的2倍體積。6.4環境噪音低于70dB。6.5光照4采用14h光照10h黑暗的方式飼養。光照時間內，飼育魚房內和魚缸水面光照強度均為54lx~6.6飼育用水6.6.1電導率450μS/cm~550μS/cm。6.6.2pHpH6.5~pH8.0。6.6.3氨氮含量＜0.02mg/l。6.6.4鹽度含量為0.3‰~0.5‰。6.6.5亞硝酸鹽含量＜0.2mg/l。6.6.6硝酸鹽含量＜5mg/l。6.6.7溶解氧含量為5mg/l~8mg/l。6.6.8二氧化碳含量為＜5mg/l。6.6.9硬度50mg/l~100mg/l。6.7流水循環速度小于10dpf的仔魚所在魚缸的水流速度應小于10ml/min，10dpf至28dpf仔魚所在魚缸的水流速度為50ml/min~80ml/min，幼魚和成魚魚缸水流速度100ml/min~150ml/min。6.8日換水量6.8.1日排水量為系統總水量的2%~10%，根據系統中所負荷魚量適當增加。6.8.2日常繁育斑馬魚的飼育用水符合GB/T31962《污水排入城鎮下水道水質標準》，可直接排入城鎮下水道。6.8.3實驗區內用于斑馬魚實驗處理的飼育用水應按照生物類實驗室的要求處理，不應直接排入城鎮下水道。7飼育密度與餌料及飼喂57.1飼育密度7.1.1胚胎飼育密度10ml飼育用水飼育的胚胎數不超過50枚。7.1.2仔魚飼育密度4dpf~17dpf仔魚的飼育密度不超過40尾/l、大于18dpf的仔魚飼育密度不超過20尾/l。7.1.3幼魚飼育密度不超過6尾/l。7.1.4成魚飼育密度5尾/l。7.2飼育餌料7.2.1斑馬魚餌料包括草履蟲活體和豐年蟲幼蟲活體，可自行培育或購買。7.2.2草履蟲培育方法見附錄A。培育出的草履蟲活體直接用于斑馬魚仔魚的飼喂。7.2.3豐年蟲幼蟲孵化方法見附錄B。孵化出的幼蟲經脫鹽處理后用于斑馬魚的飼喂。7.3飼喂7.3.1飼喂總則斑馬魚的每日飼喂次數為2次~4次。7.3.2飼喂量7.3.2.1發育時期為4dpf~6dpf仔魚，每次按草履蟲1×105個/l~3×105個/l投喂。發育時期為7dpf~10dpf仔魚，以草履蟲和豐年蟲幼蟲混合喂飼，草履蟲每次投喂密度為3×105個/l~5×105個/l，豐年蟲為1×104個/l~4×104個/l，依發育時間逐步提高豐年蟲比例。發魚時期為11dpf~28dpf仔魚，以豐年蟲幼蟲飼喂，飼喂量為約3×104個/l~4×104個/l。7.3.2.2幼魚每次投喂豐年蟲幼蟲5×104個/l~9×104個/l。7.3.2.3成魚每次投喂豐年蟲幼蟲1×105個/l~3×105個/l。8繁育和遺傳資源保存8.1繁育安排使用交配缸進行斑馬魚交配繁育。親本的雌雄比例為雌2尾雄1尾~2尾，一個交配缸內最多不超過7尾魚。8.2新創制遺傳資源保存根據國家斑馬魚資源中心的要求填寫相關表格，向國家斑馬魚資源中心遞交新創制的基因組改造的詳細遺傳信息；同時遞交新創制的基因型和遺傳背景明確的斑馬魚成魚，用于國家斑馬魚資源中心保存。69倫理維護9.1福利保障應制定斑馬魚使用與管理的具體規章制度；不應執行任何不符合動物倫理學規范的斑馬魚使用與管理方案。9.2飼育人員技能斑馬魚生產與使用人員應在上崗前接受專業培訓，了解斑馬魚繁殖生物學的基本知識、飼育規范以及使用與管理規范等。9.3生長記錄記錄每日的水溫、室溫、濕度、飼喂、清潔、整理、魚缸清洗、受精卵收集、草履蟲飼育和豐年蟲幼蟲孵化情況等。9.4標識黏貼在飼育缸或交配缸外的斑馬魚標簽的信息應包括：動物的受精日期、基因型和傳代代數等內容。9.5安樂死將斑馬魚置于冰水混合物中快速預冷2min后，放入-20℃冰箱凍存。斑馬魚安樂死后應及時轉移至飼育魚房外的專用斑馬魚尸體存放冰箱的冷凍室中凍存，集中進行無害化處理。10質量規范10.1斑馬魚來源斑馬魚的遺傳背景應該明確。不應飼育遺傳背景不明的斑馬魚；不應使用來源于寵物市場的斑馬魚。10.2胚胎的質量應具備與發育時期一致的正常的顯微形態學特征。10.3仔魚的質量10.3.1應從殼膜中孵出，具正常的顯微形態學特征，可在水中自由游泳。10.3.24dpf仔魚魚鰾的后部腔室開始充氣。約20dpf，仔魚魚鰾的前部腔室開始充氣。約21dpf時，魚鰾前后兩個腔室的充氣完成。10.4幼魚與成魚的質量10.4.1健康的斑馬魚應保持充分放松的姿態以與水面平行的方式在水中游泳。10.4.2斑馬魚的正常行為包括均勻的呼吸（通過活動鰓蓋）、以及保持對游泳和捕食運動的興趣。10.4.3斑馬魚生病的特征包括體重與體長的比例下降、急促的呼吸、明顯的身體組織的損傷（潰瘍、外傷）、以及體色、體型和運動方式等的改變。當斑馬魚急速翻身、向一側傾斜、或者與水面垂直也可以作為生病的特征。10.4.4表現出異于正常斑馬魚行為的基因組改造斑馬魚突變體，不應視作病魚。10.4.5生病的斑馬魚通常要進行及時的安樂死。10.4.6如果病魚十分珍貴，可將病魚轉移至隔離區隔離治療。8（資料性）草履蟲培育在3l缸中加入0.1g氯化鈉（分析純）和約5粒大麥粒，倒入1.5l~2l煮沸去離子水后混勻，放置室溫待用，待溶液降至室溫后加入0.1g酵母粉搖勻備用，吸取母液10%作為種子液，加入混合好的新鮮培養液中，室溫下培養1周，于體視顯微鏡下檢測培養效果，一般可達到2,000個/ml的草履蟲，此時可直接使用。3周~4周后需利用種子液，再行培養新鮮草履蟲。9（資料性）豐年蟲幼蟲孵化及脫鹽處理豐年蟲幼蟲是通過購買市售的豐年蟲休眠卵孵化而來。孵化使用符合GB5749《生活飲用水衛生標準》要求的市政自來水配制的溶液完成。孵化溶液含鹽量（使用50目以下的細海鹽或孵化專用海鹽）為1.5%~2.5%；pH8.0~p