丙泊酚通過miR-133a-5p/MAPK6對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究研究背景:肝臟缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷是肝臟手術常見的生理變化,大量研究證實,肝臟I/R損傷是肝臟手術后肝臟功能低下、肝淤血、進行性血栓形成及移植物無功能等并發癥的主要原因。同時,由于缺氧/復氧過程中,細胞內活性氧的形成、淋巴細胞和中性粒細胞的活化等嚴重損害肝細胞,繼而導致炎癥的發生乃至細胞的凋亡。新近研究發現,在肝臟手術后,由肝臟I/R造成的死亡率明顯上升,然而由于其復雜的生理生化過程,目前尚無統一有效的預防和治療方法。因此,尋找合適的藥物,有效控制肝臟I/R損傷是當今醫學界的一大熱點和難點。丙泊酚(Propofol)是一種新型快速短效的靜脈麻醉藥,其臨床特點是起效快、持續時間短、蘇醒迅速而平穩,不良反應少,現已廣泛應用于臨床各科手術麻醉。近年來,越來越多的研究證明丙泊酚在肝臟I/R損傷中起到保護作用,然而其具體保護機制尚未闡明。有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族,其級聯反應是通過改變蛋白質的磷酸化水平將信號從細胞外轉到細胞內,并向下游傳遞。MAPKs參與機體內氧化應激反應,其通過將受體接受的胞外信號轉入細胞核,參與調控基因的表達、細胞的生長、發育、分化和凋亡等一系列生理過程。近年來,越來越多的證據表明,MAPK信號通路參與機體內一系列I/R過程,并且可能引起組織器官結構和功能的改變。有絲分裂原激活蛋白激酶6(mitogen-activatedproteinkinase6,MAPK6)是MAPK家族的重要成員之一,其表達上調顯著增加細胞的凋亡,參與肝癌的發生和發展過程。然而,MAPK6在肝臟I/R中的作用待進一步研究。MicroRNA(miRNA)是一類非編碼小RNA,長度大約為22個核苷酸。MiRNA在生物進化中比較保守,從低等生物如細菌,病毒等到動植物的基因組中均有存在。研究證實,miRNA廣泛參與基因的表達調節,及細胞生長、分化、凋亡等重要的生命活動,是生物體內一種重要的調節手段。已有研究發現多種miRNA參與肝臟I/R損傷,其中miR-133a被證實是一個與I/R損傷密切相關的miRNA。MiR-133a可以通過靶向調控死亡相關蛋白激酶2(deathassociatedproteinkinase2,DAPK2)進而抑制心肌細胞的凋亡,發揮對I/R心肌的保護作用。同時,miR-133a-5p也被證實可通過靶向調控DAPK2蛋白抑制I/R引起的心肌細胞凋亡。此外,miR-133a-5p還可通過靶向FSCN1抑制肝癌細胞增殖和遷移,增加肝癌細胞凋亡。然而,miR-133a-5p在肝臟I/R損傷中的作用尚未闡明。本文通過通過生物學軟件預測發現,miR-133a-5p與MAPK63’UTR區存在結合位點,表明MAPK6可能是miR-133a-5p的下游調控靶分子之一。基于以上背景,本研究首先丙泊酚預處理待建模型大鼠,然后建立肝臟I/R大鼠模型,利用全自動生化分析儀檢測肝臟損傷標記物水平,同時利用qRT-PCR和westernblot進一步檢測病大鼠肝臟組織中MAPK6和miR-133a-5P的表達;其次建立肝細胞缺氧/復氧模型,進一步探討丙泊酚在肝臟細胞H/R損傷保護中的分子機制;最后通過大鼠肝臟I/R在體實驗進一步驗證丙泊酚在肝臟I/R損傷的保護作用及潛在機制。本文旨在進一步闡釋丙泊酚對肝臟I/R損傷的保護作用機制,為丙泊酚的臨床應用提供實驗基礎和理論指導。研究內容分為3部分:第一部分:丙泊酚在大鼠肝臟I/R損傷中的保護作用及其對miR-133a-5p和MAPK6表達的影響目的:觀察丙泊酚對大鼠肝臟I/R損傷的保護效應及其對miR-133a-5p和MAPK6表達的調控。方法:1.丙泊酚預處理大鼠,構建大鼠肝臟I/R損傷模型,收集假手術組、I/R組和丙泊酚干預組大鼠血清,全自動生化分析儀直接檢測血清中AST和ALT的水平。2.處死所有實驗大鼠,取肝臟組織后,qRT-PCR檢測組織中miR-133a-5p和MAPK6mRNA的表達水平;westernblot檢測肝臟組織中MAPK6蛋白表達水平。3.人正常肝細胞QSG-7701培養于含有10%FBS和1%雙抗的RPMI-1640培養基中,缺氧/復氧組先后給予缺氧和復氧處理。4.細胞處理完成后,qRT-PCR檢測細胞中miR-133a-5p和MAPK6mRNA的表達水平;westernblot檢測肝細胞中MAPK6蛋白表達水平。結果:1.與假手術組大鼠相比,肝臟I/R損傷模型大鼠AST和ALT的血清水平顯著升高;而丙泊酚干預組模型大鼠血清中AST和ALT的水平顯著低于肝臟I/R損傷模型大鼠。2.肝臟I/R可顯著抑制大鼠肝組織中miR-133a-5p表達,而丙泊酚預處理可顯著上調其表達;MAPK6在I/R損傷的肝臟組織中表達顯著升高,而丙泊酚預處理顯著抑制MAPK6在I/R模型肝臟組織中的表達;3.缺氧/復氧處理導致肝細胞中miR-133a-5p表達顯著降低,但MAPK6的mRNA和蛋白表達水平顯著升高。與缺氧/復氧處理組相比,缺氧/復氧和丙泊酚預處理顯著上調miR-133a-5p表達并抑制MAPK6的mRNA和蛋白表達。結論:1.丙泊酚預處理可顯著降低肝臟I/R模型大鼠AST和ALT的血清水平,進而保護肝臟I/R損傷。2.肝臟I/R模型大鼠肝臟組織中miR-133a-5p表達降低而MAPK6表達顯著升高;丙泊酚預處理上調了模型大鼠肝臟組織中miR-133a-5p表達同時下調了MAPK6表達。3.建立正常肝細胞QSG-7701病理模型,缺氧/復氧處理引起細胞中miR-133a-5p表達降低而MAPK6表達升高;丙泊酚預處理細胞逆轉了缺氧/復氧對肝細胞的作用,同時伴隨著miR-133a-5p表達升高,MAPK6表達降低。第二部分:丙泊酚在缺氧/復氧誘導肝細胞凋亡中的作用及其調控miR-133a-5p/MAPK6表達的機制研究目的:細胞水平探討丙泊酚對肝臟I/R損傷保護作用的分子機制。方法:1.生物信息學軟件分析miR-133a-5p與MAPK的序列關系;取MAPK63’UTR部分構建熒光載體,轉入肝細胞,雙熒光素酶報告基因法鑒定miR-133a-5p與MAPK的調控關系。2.分別構建miR-133a-5p過表達載體和抑制表達載體,并轉染肝細胞,real-timePCR和westernblot檢測細胞中MAPK6的表達。3.建立肝細胞缺氧/復氧模型,并轉染miR-133a-5p過表達載體,qRT-PCR和westernblot檢測MAPK6的表達。4.建立肝細胞缺氧/復氧模型,在缺氧/復氧處理前進行丙泊酚預處理,同時構建miR-133a-5p抑制表達載體并轉染細胞,qRT-PCR和westernblot檢測MAPK6的表達。5.建立肝細胞缺氧/復氧模型,在缺氧/復氧處理前利用丙泊酚處理,同時構建MAPK過表達表達載體并轉染細胞,TUNEL檢測細胞凋亡水平。結果:1.MiR-133a-5p負調控MAPK6的表達,過表達miR-133a-5p顯著下調MAPK6的mRNA和蛋白水平的表達,干擾miR-133a-5p顯著上調MAPK6的mRNA和蛋白水平的表達。2.肝細胞缺氧/復氧處理顯著上調MAPK6的表達,而過表達miR-133a-5p顯著逆轉了該結果。3.丙泊酚預處理顯著抑制了缺氧/復氧引起的肝細胞中MAPK6表達的上調,而干擾miR-133a-5p消除了丙泊酚對MAPK6表達的影響;4.缺氧/復氧顯著增加了肝細胞的凋亡,丙泊酚預處理抑制了缺氧/復氧誘發的肝細胞凋亡,而過表達MAPK6消除了丙泊酚對肝細胞的保護作用。結論:丙泊酚預處理通過上調miR-133a-5p抑制MAPK6表達進而抑制了缺氧/復氧誘發的肝細胞凋亡。第三部分:抑制miR-133a-5p對丙泊酚緩解大鼠肝臟I/R損傷影響的觀察目的:體內實驗驗證丙泊酚在肝臟I/R損傷中的保護作用機制。方法:1.實驗分組為肝臟I/R組(HI/R)、肝臟I/R+丙泊酚組(HI/R+propofol)、肝臟I/R+丙泊酚+NC組(HI/R+propofol+NC)、肝臟I/R+丙泊酚+miR-133a-5pinhibitor組,全自動生化分析儀直接檢測不同處理組大鼠AST和ALT的血清水平;2.取上述實驗中所有大鼠的肝臟組織,qRT-PCR和westernblot檢測肝臟組織中MAPK6mRNA和蛋白的表達水平。結果:1.肝臟I/R大鼠血清中ALT和AST的水平顯著上調,丙泊酚預處理下調了ALT和AST水平,而miR-133a-5pinhibitor取消了丙泊酚對肝臟損傷的保護作用。2.大鼠肝臟缺血再灌組大鼠MAPK6的表達水平顯著上調,丙泊酚預處理下調了MAPK6的表達水平,而miR-133a-5pinhibitor取消了丙泊酚對損傷肝組織中MAPK6表達的影響。結論:體內實驗證實丙泊酚通過miR-133a-5p調節