丙泊酚預處理對肝臟缺血再灌注損傷的作用及機制研究[研究目的]探索丙泊酚用于預防肝臟缺血再灌注損傷的可行性及其機制,探索一種新型有效副作用小的肝臟缺血再灌注損傷保護藥物。臨床肝臟手術常需要暫時阻斷肝臟供血,當供血恢復,大量自由基生成及脂質過氧化等病理過程導致的肝臟I/R損傷是肝臟外科手術和肝臟移植術中面臨的一個亟待解決的問題。肝臟I/R損傷是導致肝移植失敗及多器官衰竭的主要原因之一,它是由于肝臟短暫缺血后恢復血流供應,大量有毒代謝產物及炎性介質釋放導致嚴重的代謝紊亂,從而加重肝臟損傷及功能障礙的過程。肝臟I/R損傷是多種機制共同作用的結果,與ROS產生、炎癥反應及細胞凋亡等機制密切相關。因此,合理選擇用藥,干預自由基產生、抑制炎癥反應及細胞凋亡或可減輕肝臟I/R損傷。丙泊酚是臨床常用靜脈麻醉藥物,因其化學結構與維生素E相似,被報道具有廣泛的抗氧化、抗炎及抗凋亡的效應。大量文獻報道,丙泊酚預處理能通過多種分子機制,作用于多條信號通路而有效減輕1/R誘導的多器官損傷。然而,盡管有少數文獻報道,丙泊酚在肝臟I/R損傷中的作用及其確切機制尚不明確,其保護效應尚缺乏臨床試驗佐證。基于此,本研究在前期文獻報道的基礎上,結合體外實驗、動物及臨床試驗,系統性的研究丙泊酚肝臟I/R損傷的保護效應,并初步探討其機制。[研究方法]1.丙泊酚預處理對缺氧/再灌注肝細胞的保護效應及機制研究人體外培養肝細胞HL-7702分為對照組、I/R組(缺氧8h后恢復供氧培養建立I/R損傷模型)、丙泊酚組(細胞缺氧操作前30min加入不同濃度丙泊酚5、10、20、40μmol/L);觀測細胞恢復供氧后加入不同濃度丙泊酚及丙泊酚預處理后24h細胞變化情況:MTT法研究細胞增殖活性;Annexin-V/PI雙染流式細胞技術測定細胞凋亡,WesternBlot檢測凋亡相關蛋白Caspase-3及Bcl-2的表達;JC-1熒光探針及細胞ATP含量測定評價細胞線粒體結構及功能的損傷;采用試劑盒及生化分析儀檢測細胞裂解產物氨基轉移酶評價肝細胞功能;測定細胞裂解產物SOD、MDA、CAT水平評價細胞抗氧化水平。2.丙泊酚對大鼠肝臟缺血/再灌注損傷的作用及機制研究Wistar大鼠平均分為對照組(n=10)、假手術(n=10,行剖腹手術)、I/R組(n=10,腹腔手術,肝臟血管夾閉90min后恢復供血,建立肝臟I/R損傷模型)、丙泊酚組(n=10,I/R建模前30分鐘給予50mg/kg丙泊酚腹腔內注射)。其中對照組大鼠不做任何處理。假手術組大鼠注射戊巴比妥麻醉后,在無菌條件下進行剖腹手術,而后常規關閉腹腔。I/R組大鼠麻醉后,無菌條件下行剖腹術,用無創動脈夾夾閉肝左葉與中葉血管,同時保留肝右葉與尾狀葉的血管、門靜脈及膽總管,造成約70%的血管阻塞,待缺血區肝葉顏色由鮮紅色變為暗紅色,表明肝臟缺血模型成功,持續夾閉約90min。而后取下無創動脈夾,恢復肝臟血流。6h后在無菌條件下進行大鼠腹部縫合。丙泊酚組大鼠則按照50mg/kg腹腔內注射丙泊酚,30分鐘后立即進行無創動脈夾夾閉肝左葉與中葉血管,同時保留肝右葉與尾狀葉的血管、門靜脈及膽總管,其余操作同I/R組。24h后測定大鼠血清AST、ALT、ALB(白蛋白)及TBIL(總膽紅素)水平,評價大鼠肝臟功能;肝組織切片H&E染色及電鏡觀察肝臟組織損傷程度;取大鼠肝臟組織勻漿,測定MDA、SOD、CAT濃度評價大鼠抗氧化水平;檢測肝臟組織ATP含量,評價大鼠能量代謝水平;測定肝組織勻漿中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-10及TGF-β的濃度,研究大鼠肝臟炎癥反應;TUNEL染色、WesternBlot測定凋亡相關蛋白的表達,檢測肝臟組織細胞凋亡情況。3.丙泊酚對肝移植患者缺血再灌注損傷的影響研究選取山東大學山東省立醫院肝膽外科2017年5月-2018年5月行肝臟移植術患者共42例,其中術中肝臟缺血前予以丙泊酚處理的患者18例(PPC),未進行丙泊酚處理的患者24例。再灌注后3h取移植肝組織,H&E染色觀察肝臟病理;于術前及術后不同時間點檢測患者血清氨基轉移酶、總凝血酶原時間(PT)及總膽紅素(TBIL)水平,評價患者肝功能;檢測血清MDA及H202水平,評價患者氧化應激水平。[結果]1.觀測丙泊酚預處理對細胞的影響,結果顯示細胞缺氧8h再恢復供氧培養24h后,其增殖活性顯著低于對照組(分別約降低17%),提示缺氧/再灌注能顯著抑制體外培養肝細胞的增殖活性。不同濃度(5、10、20、40(μmol/L)的丙泊酚預處理也顯著提高缺氧/再灌注誘導的HL-7702細胞增殖活性的降低(約提高10%-17%,p<0.05)。機制上發現,丙泊酚通過抑制促凋亡蛋白Caspase-3的表達并促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,一定程度減輕缺氧/再灌注誘導的細胞凋亡(細胞總凋亡率約降低3%,p>0.05)。丙泊酚預處理能顯著逆轉缺氧/再灌注誘導的肝細胞線粒體膜電位的下降(p<0.01),促進ATP生成(與I/R組比較提高2-3.5倍,p<0.05),呈現明顯的劑量依賴性。短暫缺氧/再灌注能顯著提高HL-7702細胞ALT(1.8倍)及AST水平(1.47倍,p<0.01),而不同濃度丙泊酚預處理能有效降低缺氧/再灌注細胞裂解液AST及ALT濃度,具有明顯的劑量依賴性(p<0.05)。缺氧/再灌注能加重肝細胞脂質過氧化的程度(MDA水平約升高2.7倍,p<0.001),下調抗氧化酶SOD(2.1倍)及CAT(2.3倍)的水平,而不同濃度丙泊酚預處理能有效逆轉缺氧/再灌注引起的細胞抗氧化水平的下降(p<0.05)。2.肝臟I/R處理能顯著誘導大鼠血清ALT及AST水平的升高(分別約升高5.1倍及2.6倍,p<0.001),手術前腹腔注射丙泊酚能顯著降低I/R誘導的血清ALT及AST水平的升高(與I/R組比較,分別約降低1.6倍及1.7倍,p<0.01),降低大鼠血清ALB水平(約降低30%,p<0.01)并促進大鼠血清TBIL水平的升高(約升高1.67倍,p<0.01),而丙泊酚能有效逆轉肝臟I/R誘導的大鼠肝功能障礙(p<0.05)。H&E染色及電鏡顯示丙泊酚預處理可減輕由缺血再灌注導致的肝臟組織受損程度。I/R處理加重肝臟組織內部的脂質過氧化程度(MDA升高1.87倍,p<0.01),抑制SOD及CAT水平(分別約降低1.67及2.9倍,p<0.01),丙泊酚能有效逆轉肝臟I/R誘導的大鼠抗氧化水平的降低(與I/R組比較,MDA水平降低28%,SOD及CAT水平分別升高1.52及1.95倍,p<0.01)。I/R組大鼠肝臟組織中TNF-α及IL-6含量顯著高于對照組(分別約升高3.38及3.77倍,p<0.01),而IL-10及TGF-β的濃度顯著低于對照組(分別約降低3.14及2.43倍,p<0.01),丙泊酚預處理能有效逆轉上述炎癥因子的分泌(p<0.01)。丙泊酚預處理能通過促進caspase-3蛋白表達同時抑制Bcl-2蛋白表達而減輕I/R誘導的大鼠肝臟組織細胞凋亡。3.丙泊酚預處理能顯著減輕I/R誘導的肝移植患者肝臟的損傷(與NPC組比較,PPC組患者肝臟病理評分約降低19.2%,p<0.01)。手術結束、術后6h、24h、2dPPC組患者血清ALT及AST水平顯著低于NPC組(p<0.05),術后24h內PPC組患者PT顯著低于NPC組(p<0.05),術后6h、2d、3d、5dPPC組患者TBIL也顯著低于NPC組(p<0.05)。灌注后3h、術后1天,PPC組患者血清MDA水平顯著低于NPC組(p<0.01),灌注后3hPPC組患者血清H202水平也顯著低于NPC組(p<0.01)。[結論]1.丙泊酚預處理能通過抑制肝臟I/R誘導的細胞線粒體損傷,促進能量代謝恢復,上調細胞抗氧化水平,減輕脂質過氧化反應,調節凋亡相關蛋白的表達,同時減輕肝臟炎癥反應,從而促進肝細胞增殖,降低細胞凋亡,最終減輕肝臟損傷并促進肝臟功能恢復