ICS

65.020.30CCS

B44

43

myxosporean

DB

43/T

2816—2023前言................................................................................

II1 范圍..............................................................................

12 規范性引用文件....................................................................

13 術語和定義........................................................................

14 試劑與材料........................................................................

15 儀器與設備........................................................................

16 采樣..............................................................................

27 檢查步驟..........................................................................

28 結果判定..........................................................................

3附錄

A（規范性）

........................................................

4附錄

B（資料性） 不同粘孢子蟲感染癥狀及包囊形態

......................................

5附錄

C（資料性）

........................................

6DB

43/T

2816—2023 本文件按照

GB/T

1.1—2020 第

1

部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由湖南省農業農村廳提出。本文件由湖南省農業標準化技術委員會歸口。究所。IIDB

43/T

2816—20231 范圍本文件適用于魚類粘孢子蟲的檢測。2 規范性引用文件文件。SC/T

SC/T

7223.1

黏孢子蟲病診斷規程

第

1

部分：洪湖碘泡蟲SC/T

7223.2

黏孢子蟲病診斷規程

第

2

部分：吳李碘泡蟲SC/T

7223.3

黏孢子蟲病診斷規程

第

3

部分：武漢單極蟲SC/T

7223.4

黏孢子蟲病診斷規程

第

4

部分：吉陶單極蟲SN/T

淡水魚中寄生蟲檢疫技術規范3 術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4 試劑與材料本標準所使用的試劑均為分析純，水為蒸餾水。乙醇：乙醇。溴酚藍。10xPCR

Buffer

：-20℃保存，避免反復凍融。引物序列上游引物：

TTT

A-3’；下游引物：

TTA

C-3’；本對引物擴增小核糖體小亞基

rRNA

基因（18S

rDNA）的部分序列。DNA

marker

2000（bp）:

2000、、750、、250、100。5 儀器與設備解剖盤、剪刀、鑷子、解剖針、解剖刀。體視顯微鏡和帶測微標尺的光學顯微鏡。蓋玻片、載玻片、培養皿、巴氏吸管。恒溫水浴鍋（控溫范圍：1DB

43/T

2816—2023-20℃和-80℃冰箱。微量移液器（0.5

μL～10

μL，10

μL～100

μL，100

μL～

μLPCR

擴增儀。離心管和

PCR

高壓滅菌鍋。超凈工作臺。水平電泳系統。紫外透射儀或凝膠成像系統。6 采樣樣品的采集應符合

SC/T

7103、

7223.1、SC/T

7223.2、SC/T

7223.3

和

SC/T

7223.4

中的相關要求，樣品封存和運輸應符合

SC/T

7103

的相關規定。7 檢查步驟目檢

2503

括體腔、脂肪組織、胃腸、肝、脾等。鏡檢7.2.1當在

7.1

再用解剖針戳破疑似包囊物，加入約

20

μL

-30

μL

雙蒸水，蓋上蓋玻片置于光學顯微鏡中觀察是否存在成熟孢子。7.2.2 當在魚體組織中未發現疑似包囊狀物時，用剪刀或鑷子取少量組織或液體（膽汁、血液、尿液等）置于載玻片上，用鑷子將組織分散，加入約

20

μL

μL

雙蒸水，蓋上蓋玻片，稍加壓平，置于光學顯微鏡中觀察是否存在成熟孢子。分子鑒定7.3.1 檢測樣本固定將

6.2

70%附錄

A），低溫（-20℃）保存，標識好標簽并記錄。7.3.2 DNA

提取將

6.2

℃冰箱快速冷凍

5

80℃水浴鍋中

5

極絲是否擠出。破碎后利用細胞/

DNA

提取試劑盒，提取樣品基因組

。提取好的基因組DNA

置于-20℃保存備用。7.3.3 PCR

擴增DB

43/T

2816—2023在

50

μL

的

PCR

反應體系中，包含模板基因組

DNA

2

μL、10×PCR

Buffer

MIX（康為世紀）25μL、上游引物和下游引物（

μM/L

2

μL、加雙蒸水定容至

50

μL。在

PCR

94

4

min；94℃變性

1

；46℃退火

50s；65℃延伸

1

min,35

個循環；65

10

min。PCR

擴增時，應設置陰性對照和陽性對照。7.3.4 PCR

產物電泳與測序取

5

PCR

1.0%

A

DNA

900bp

在，則取

PCR

GenBank

進行

BLAST

比對。8 結果判定目檢當肉眼觀察到明顯白色包囊或白色囊狀物（見附錄

B），可以懷疑為粘孢子蟲感染，但需經

、8.3

步驟檢查后才能進一步確診。鏡檢8.2.1 將經

8.1

步驟檢查未觀察到明顯包囊的組織進一步置于解剖鏡下，觀察是否有肉眼不可見的白色包囊（見附錄

B），如觀察到需將其從組織中分離，并經

7.2.2

8.2.2 將經

和

步驟觀察的疑似包囊以及外觀正常的少量組織進行壓片，觀察到明顯的粘孢子蟲成熟孢子即可確診（見附錄

C分子鑒定將所測定的

rDNA

序列（900

GenBank

數據庫中粘孢子蟲序列進行比對，如比對出來的種類均為粘孢子蟲序列相似性在

80%以上，亦可判定為粘孢子蟲。DB

43/T

2816—2023

附 錄

A（規范性）試劑及其配制A.1 70%乙醇溶液70

無水乙醇溶液，加

30mL

PBS

0.01

mol/L,

pH7.4）。A.2 磷酸鹽緩沖液（0.01

mol/L,

pH7.4）稱

7.9g

NaCl，

，0.24g

KH2PO4（or

1.44g

Na2HPO4

K24，溶于

ml

蒸餾水中，用

HCl

調節溶液的

pH

值至

7.4，最后加雙蒸水定容至

1

L，4℃冰箱保存。A.3 TAE

電泳緩沖液（50

倍）稱量

242.0

g

Tris

堿、37.2

g

Na2EDTA·2H2O

混合，然后加入

800

mL

再加入

57.1ml

1L，室溫保存。A.4 溴酚藍指示劑溶液取溴酚藍

100

mg，加雙蒸水

5

在室溫下過夜，待溶解后再稱取蔗糖

25

g，加雙蒸水溶解后移入溴酚藍溶液中，搖勻后加雙蒸水定容至

50

mL，加入氫氧化鈉（NaOH）溶液

1

滴，調至藍色。DB

43/T

2816—2023

附 錄

B（資料性）不同粘孢子蟲感染癥狀及包囊形態圖

不同粘孢子蟲病感染癥狀(A)=1

；(B)：吉陶單極蟲感染散鱗鏡鯉皮膚癥狀，靶尺=5

cm；(C)：米氏碘泡蟲感染鯰腸道癥狀，靶尺=5

cm；