苦蕎中黃酮類化合物的研究

小麥是適合在寒冷條件下生長的短季蓼科品種。植物學主要包括苦蕎、天竺葵和甜蕎的兩個食品種子。蕎麥富含高生物價的蛋白質、維生素、礦質元素等,最為重要的是含有極為豐富的生物活性成分—黃酮類化合物,尤其是苦蕎,其黃酮含量比甜蕎高10~100倍,它是黃酮的重要膳食來源,苦蕎(韃靼蕎麥)黃酮已獲得美國“國家食品與藥物管理局”FDA證書。目前對于甜蕎中的黃酮化合物研究較多,而對苦蕎中的黃酮研究報道較少。近年來,高效液相色譜,尤其是反相液相色譜(RP-HPLC)已廣泛用天植物酚類物質的分析,特別是液質聯用(HPLC-MS)結合二極管陣列檢測器(DAD)集分離與鑒定于一體,在定向篩選某些結構的化合物時,顯示了強大的檢測功能。本文的目的是利用RP-HPLC-DAD/MS,結合資料報道,試圖在苦蕎中探尋尚未有報道過的黃酮種類,并對籽粒各部分(殼、麩皮、外層粉、內層粉)的黃酮進行定量測定。1材料和方法1.1藥物、試劑和儀器苦蕎麥籽粒(含水量16.0%)購自四川西昌,經西德Brabander-880200型磨粉機碾磨、篩分后,得殼、麩皮和全粉三部分(表1)。外層粉、心粉由四川涼山州提供。山西苦蕎粉購自山西晉城。蘆丁、桑色素生化試劑,上海試劑二廠;槲皮素日本,半井化學·品株式會社;山奈酚標樣中國科學院植物化學研究室提供。1.2心粉提取物的制備分別準確稱取四川苦蕎樣品(殼、麩皮、全粉、外層粉、心粉)2g,濾紙包好后置于索氏抽提器中,加入80ml80%甲醇,85℃條件下提取6h,定容至100ml,待測定。1.3質譜esi-/ms分析條件苦蕎麩皮提取液經0.45μm微孔濾膜過濾后,5μl直接進樣分析。Waters2690型高效液相色譜儀,Waters996型二級管陣列檢測器(DAD)(200~600nm),色譜柱:symmetryC8柱(2.1×150mm,5μm),甲醇為流動相A,1%乙酸為流動相B,洗脫條件:0→20min,流動相A15%→100%,流速:0.3ml/min。MicroMassZMD400型電噴霧質譜(ESI)儀,色譜柱流出組份進入質譜儀的流速為10μl/min,正離子質譜(ESI+/MS)條件:毛細管電壓3.88KV,錐孔電壓53V,離子源溫度120℃,脫溶溫度200℃。負離子質譜(ESI-/MS)條件:毛細管電壓3.76KV,錐孔電壓48V,離子源溫度120℃,脫溶溫度200℃。數據采集與分析軟件為Masslynxdatasystem(version3.1,Micromasslimited,UK)1.4苦蕎黃酮的含量1.4.1總黃酮及總黃酮的測定移取定量樣品液于10ml容量瓶中,以1%AlCl3定容至刻度線,于420nm波長處進行比色測定,以蘆丁標樣計算總黃酮。試劑空白為參比。1.4.2silods法為提高分析效率,我們采用以下色譜條件進行定量分析:HPAgilent1100高效液相色譜儀,色譜柱:HypersilODS(4.6×100mm,5μm),可變波長檢測器(VWD)波長354nm。流動相A:65%甲醇(含0.5%乙酸),流動相B:超純水(含0.5%乙酸),洗脫條件(表2),流速:0.8ml/min。進樣量:5μl,10min內完成樣品分析。以蘆丁為標樣,峰面積外標法定量。分析兒茶素時,波長選定為280nm。2結果與討論2.1黃酮類化合物目前對甜蕎的黃酮研究報道較多。SatoHetal從蕎麥未成熟的種子中分離鑒定了蘆丁、槲皮素、櫟皮素、金絲桃苷等黃酮醇。WatanabeM等從蕎麥種殼中分離得到原兒茶酸、槲皮素、金絲桃苷、蘆丁和3,4-二羥基苯甲醛以及牡荊葡基黃酮和異牡荊葡基黃酮,并從蕎麥種子中得到了四種兒茶素:(-)-表兒茶素,(+)-兒茶素-7-O-(-D-吡喃葡萄糖苷,(-)-表兒茶素-3-O-P-羥基苯甲酸鹽,(-)-表兒茶素3-O-(3,4-dl-O-甲基)櫚酸鹽。Dietrych-Szostak,Dorotaetal在蕎麥籽粒中分離、鑒定了6種黃酮類化合物:蘆丁、orientin、isoorientin、槲皮素、牡荊葡基黃酮、異牡荊葡基黃酮。SamiyaGCetal從蕎麥籽粒中分離出兩種新二氫黃酮醇糖苷:Aromadendrin3-O-半乳糖苷和毒葉素3-木糖苷(taxifolin3-O-xyloside)。Jian-YaOianetal發現了白藜蘆醇,原兒茶酸/兒茶素。相對于甜蕎來說,目前對苦蕎黃酮的研究還非常有限。李丹博士在四川苦蕎中發現四種主要黃酮類化合物:蘆丁(610)、槲皮素(301)、槲皮素-3-蕓香糖葡萄糖苷(772)、山奈酚-3-蕓香糖苷(594),他為了定量槲皮素-3-蕓香糖葡萄糖苷而對其進行分離純化,在收集水洗脫液時又發現了另外一種新的黃酮類化合物,經鑒定為槲皮素-3-蕓香糖雙葡萄苷(934),但他未發現山奈酚(286)的存在。2.2四川苦艾酒黃酮2.2.1黃酮類化合物檢測作者在分析黃酮過程中利用HPLC-MS,采用Masslynxdatasystem(version3.1,Micromasslimited,UK)軟件,通過由分子量構建選擇離子的方法(輸入化合物的分子量減去1(M-1)后,如果樣品中存在該化合物,則質譜中會產生對應的選擇離子),并在李丹博士的工作基礎上,在四川苦蕎籽粒中檢測到的黃酮類化合物如圖1所示。其中槲皮素-3-蕓香糖雙葡萄糖苷的含量極少,很難在HPLC上看到色譜峰,可利用選擇離子圖鑒定其存在位置,其保留時間為(rt)為8.48min(圖2)。2.2.2川奈酚的質譜鑒定以上研究發現四川苦蕎的黃酮苷元主要是由槲皮素和山奈酚,但山奈酚在蕎麥中卻鮮有報道。為此我們試圖探尋山奈酚的存在,輸入分子量M-1=285后,我們發現了相應的選擇離子(圖3)保留時間為19.31min的選擇離子暗示著山奈酚存在的可能性,它對應于圖1中的5,可見其含量也較低。本實驗采用的是反相高效液相色譜(RP-HPLC),極性較強的苷出峰較早,羥基較多的苷元較羥基較少的苷元出峰早。5的出峰位置在槲皮素峰之后,說明該物質的極性較槲皮素小或羥基較少。5的紫外吸收光譜[二極管陣列檢測器(DAD)]的帶I在352~382nm的范圍中(圖4),我們知道黃酮的帶I吸收在304~350nm之間,黃酮醇的帶I在352~382nm,所以5為黃酮醇,且其紫外吸收與文獻報道山奈酚的266nm和367nm基本一致。在質譜圖上有明顯的分子離子峰[M-H]m/z285(圖5)。最后通過與中科院植化所提供的山奈酚標樣對照,發現兩者的HPLC保留時間完全一致。另外在M-1=285的選擇離子圖(圖3)上看到的兩個響應峰,其中17.84min處是山奈酚-3-蕓香糖苷(已鑒定)裂解的山奈酚碎片。由此我們可以推斷5為山奈酚。但通過HPLC-MS未發現桑色素(318)、櫟皮素(448)、金絲桃苷(364)、牡荊葡基黃酮(432)、異牡荊葡基黃酮、orientin(448)、isoorientin、兒茶素等黃酮的選擇離子峰,暗示著四川苦蕎中不存在這些成分。所以四川苦蕎黃酮種類主要為:槲皮素-3-蕓香糖雙葡萄糖苷、槲皮素-3-蕓香糖葡萄糖苷(I)、蘆丁(II)、山奈酚-3-蕓香糖苷(III)、槲皮素(Ⅳ)和山奈酚6種黃酮醇。不同蕎麥中的黃酮種類是由品種差異和環境因素造成的。3苦蕎黃酮的含量3.1總黃酮甘薯籽的總含量表3數據表明苦蕎中的黃酮含量較高,尤其是四川苦蕎,其種皮中的黃酮含量高達4.614%,依次是外層粉、殼及心粉。3.2黃酮類化學成分苦蕎黃酮的HPLC圖譜上(圖6),從左到右依次可明顯看到槲皮素-3-蕓香糖葡萄糖苷(I)、蘆丁(II)、山奈酚-3-蕓香糖(III)和槲皮素(IV)四種主要黃酮醇的色譜峰。山西苦蕎黃酮組成與四川苦蕎相似,這也表明植物黃酮類化學成分在其化學分類學上有著重要意義。四川苦蕎籽粒各組分中的黃酮都以蘆丁含量最高,但山西苦蕎中槲皮素含量較高(表4),這可能是品種間的差異,也可能是山西苦蕎粉貯藏環境中的水分活度較高,蘆丁分解產生槲皮素所致。通過表3與表4的數據比較發現,用AlCl3比色法測定的結果與HPLC測定的總黃酮含量基本一致,說明AlCl3比色法較適于苦蕎黃酮總量的測定,而大家常用的NaNO2-Al(NO3)3法的測定結果偏高。4川苦蕎黃酮類化學成分比較本文通過HPLC-ESI/MS,結合二極管陣列檢測器(DAD)給出的光譜特性,在四川苦蕎中檢測出山奈酚。利用液質聯用作為黃酮類化合物,尤其是微量組分定向檢測的“探路石”,具有巨大優勢。四川苦蕎黃酮種類主要為:槲皮素-3-蕓香糖苷雙葡萄糖苷、槲皮素-3-蕓香糖葡萄糖苷(Ⅰ)、蘆丁(Ⅱ)、山萘