腫瘤干細胞模型研究進展

現在，對于腫瘤的起源有兩種看法：克隆形成理論和腫瘤干燥模型。后者認為腫瘤是由一群包含各種表型和生物學特征的細胞組成,具有很強的異質性,腫瘤形成的關鍵在于其中一小部分類似于成體干細胞的腫瘤細胞,分化程度更低,致瘤能力更強,具有自我增殖及多向分化的潛能,稱為腫瘤干細胞(Cancerstemcells,CSCs)。自1994年Lapidot等在慢性髓性白血病中首次鑒定并分離CSCs后,隨后許多研究在乳腺、結腸、前列腺、胰腺、肝臟及腦等實體腫瘤中也發現了腫瘤干細胞,這些結果提示了CSCs與腫瘤間的相關性。對此,腫瘤干細胞模型的觀點認為,CSCs是引起腫瘤發生、進展的根本原因,也是導致腫瘤轉移、復發以及抗藥的關鍵因素。所以,解決腫瘤干細胞的產生及維持對攻克腫瘤具有重要意義。CSCs的特性主要依賴于特定基因表達開放和關閉的調控,除了基本的遺傳學因素研究,進一步深入分析CSCs的分子機制是目前迫切需要解決的問題。一直以來,人們都認為腫瘤的發生與進展僅是由基因異常改變引起的,包括基因突變、易位、染色質插入缺失等。而近年來,隨著基因組測序技術的進步,表觀遺傳學迅速發展,越來越多的研究者意識到,表觀遺傳學在腫瘤的調控中也占有一席之地。目前研究較清楚的表觀遺傳學機制包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑及miRNA等,它們在不改變DNA序列的情況下調控基因表達及細胞表型。同時,腫瘤基因組測序結果也顯示,腫瘤具有特異的表觀遺傳學修飾特點,是導致細胞生物學特征改變、惡性轉化的重要機制。這些結果也為CSCs的調控機制提供了線索。深入解析腫瘤干細胞與表觀遺傳學的關系,不僅是理解腫瘤生理特性的突破點,更將是推進腫瘤臨床診治的關鍵。文章主要圍繞近幾年腫瘤干細胞的特性研究及表觀遺傳學線索,重點闡述表觀遺傳學對腫瘤干細胞的調控機制。1腫瘤基因的表觀遺傳組學coto1.1基因組織結構DNA甲基化大多發生在富含CG的基因區域,由DNA轉移酶1(DNMT1)和DNA轉移酶3A、3B(DNMT3A、3B)催化形成,通過與甲基化結合蛋白(Methyl-bindingprotein,MBP)識別、結合,招募轉錄共抑制因子,進而介導轉錄抑制,是表觀遺傳學調控基因表達最常見的機制之一。組蛋白修飾常發生在組蛋白的氨基端,由于暴露在染色質外面,可接受各種化學基團的修飾,目前研究最廣的是組蛋白H3、H4上賴氨酸K的乙?；图谆?。當組蛋白高乙?；瘯r,基因轉錄激活;而組蛋白甲基化修飾,可根據賴氨酸的位置不同,產生“基因抑制或激活”的效果。其中,H3K4me3是最重要的激活性修飾,H3K27me3是最重要的抑制性修飾。染色質重塑是另一種重要的表觀遺傳學調控機制,主要涉及4種ATP-依賴染色質重塑因子SWI/SNF、CDH、INO80、IS10I。重塑因子間相互作用,通過形成重塑復合物,如BAF(SWI/SNF)、NURD、ISWI、CDH1及Tip60-p400等,改變染色質的纏繞密度,從而影響轉錄因子與DNA序列的結合,進一步調控基因表達。此外,非編碼RNA也屬于廣義的表觀遺傳學修飾范疇,尤其是微RNA(microRNA,miRNA)在基因表達調控中發揮至關重要的作用。上述表觀遺傳學修飾類型即獨立發揮功能,又相互聯系共同作用,產生“協同效應”[10~12],通過調節關鍵基因的表達維持機體穩態,而當其出現異常改變時,則會引起多種疾病,包括腫瘤。1.2其他基因組化腫瘤細胞的表觀遺傳學修飾特點包括:(1)整體的DNA低甲基化和位點特異的基因啟動子高甲基化;(2)H4K20三甲基化(H4K20me3)和H4K16乙?；?H4K16Ac)的整體下降。其中,整體的DNA低甲基化主要發生在重復序列、轉座子和基因內部,造成染色質不穩定性以及某些基因的激活(如Ras、CyclinD2、MASPIN、MAGE、LOI);而特定基因啟動子的DNA高甲基化則主要引起抑癌基因(如CDKN2、MLH1、BRCA1、VHL)及APC、WNT通路的基因沉默。此外,腫瘤細胞還存在其他特殊的表觀修飾特點,如EZH2升高,HDAC2減少;染色質重塑因子BAF47、BAF250A失活,Brm和Brg1雜合性缺失及miRNA水平異常。目前,雖然對腫瘤整體的表觀遺傳修飾特點比較明確,但對最關鍵的CSCs,表觀遺傳學是如何調控其表型及特性的,是目前科學研究的新熱點。2表1顯示了遺傳裝飾和csc控制的證據2.1表觀遺傳調控cscs是一個提供主要一個從現有的研究結果來看,腫瘤干細胞具有可塑性,即CSCs的功能和表型是動態可逆的,其產生和維持依賴于特定基因表達的“on/off”轉換,而這一點恰好符合表觀遺傳學可逆性調節基因表達的特點,為表觀遺傳學修飾調控CSCs提供了理論上的可行性。此外,在過去幾十年的研究過程中,人們逐漸明確了表觀遺傳學在細胞發育和分化中的重要作用,在細胞發育每一個進程中都伴隨有表觀遺傳修飾的改變,靈活調控著細胞的增殖與分化,使二者處于動態平衡,指導細胞生長。近年來,測序技術的進步及iPS(Inducedpluripotentstemcells)細胞的出現,對于表觀遺傳學調控發育和分化的理解有了革命性進步。最新的觀點是:表觀重編程可以極大程度上重塑細胞的多能性,是細胞分化的基礎。這些結果為表觀遺傳學參與正常干細胞的調控特性提供了強有力的依據。2.2cscs同源性的認識目前認為CSCs的來源主要有兩種可能:一是成體干細胞;二是具有干性特征的祖細胞。二者經歷基因或表觀遺傳學突變,造成癌基因、抑癌基因及其他細胞關鍵基因的表達異常,打破了細胞增殖與分化間的平衡,最終產生永生化的致癌性CSCs。近年來,許多研究結果都證實了CSCs與正常干細胞的同源性。Schepers等通過對小腸干細胞和結腸癌進行轉錄組檢測,發現兩群細胞的基因表達具有一定的相似性;類似的,成體干細胞的轉錄模式在多種上皮癌中也都得到了驗證,并發現其參與腫瘤的轉移及復發;最重要的是,ESCs(Embryonicstemcells)的基因表達模式頻繁出現于分化程度低、預后差,即CSC特性顯著的腫瘤中,表現為Oct4、Nanog、SOX2、Klf4等干性基因高表達,且干性基因Oct4、Nanog表達上調可進一步引起CSCs比例升高,抗藥性及EMT(Epithelial-mesenchymaltransition)轉換增強。另一方面,Calvanese等通過比較人ESCs、正常組織和腫瘤細胞系中相同的806個基因的DNA甲基化水平,發現腫瘤細胞中高甲基化的基因在ESC中大部分也是高甲基化的;結合CSCs與ESCs的同源性,作者認為,CSCs抑癌基因的DNA高甲基化很有可能是胚胎發育過程中ESCs分化時去甲基化受損導致的,而不是成年后額外添加的。這一觀點為CSCs的表觀遺傳學修飾來源提供了一種假說,但ESCs分化是早期事件,根據這一觀點,抑癌基因的高甲基化狀態很早就出現,與腫瘤往往發生在個體發育后期的現象矛盾?？傊?這些結果都表明CSCs與正常干細胞具有同源性,而干細胞的特性在很大程度上受表觀遺傳學的調控,所以表觀遺傳學在調節CSCs的功能和表型中也具有重要作用。研究發現,在ESCs中規律分布的染色質重塑因子和miRNA在腫瘤中則表達失調,暗示是表觀修飾的異常改變使正常干細胞特性紊亂,變為CSCs,從而使腫瘤發生。2.3環境與腫瘤干細胞巢腫瘤微環境與CSCs相互作用,對CSCs的調控有很重要的影響。與正常干細胞類似,腫瘤干細胞同樣依賴于周圍微環境的滋養與刺激,包括血管上皮細胞分泌的VEGF、淋巴細胞分泌的TNF-a、間質細胞分泌的IL-6/IL-8/SDF-1、細胞外基質分泌的TGF-B/ROS及其他調控因子對CSC信號通路的影響,共同構成一個相對獨立的“生態環境”,稱為腫瘤干細胞巢(CSCniche)。腫瘤干細胞巢一方面保護CSCs免受外界刺激因素的損傷(藥物、放療等),另一方面維持CSCs自我增殖和多向分化的潛能。例如,在肝細胞癌中改變宿主的微環境(缺氧),可顯著影響腫瘤干細胞的干性基因表達及細胞表型,類似的結果在其他腫瘤中也有報道。目前研究揭示了許多對CSCs特性有顯著影響的微環境因子,如CD44BP、TLR2及CCL2等。由此可見,腫瘤微環境可以在不改變細胞遺傳物質的情況下調控CSC的特性,而這一點與表觀遺傳學的作用方式有共通之處。研究表明,環境(包括微環境)與表觀遺傳學有非常密切的關系。Feil等指出,環境往往通過改變表觀遺產學修飾來改變基因表達,從而調節細胞行為,而改變微環境中巢細胞的表觀遺傳學修飾狀態可改變各種激素和刺激因子的分泌,從而影響細胞巢的狀態。所以腫瘤微環境對CSCs的調節必定也涉及到CSCs表觀遺傳學的改變。3修飾ctgf-bmp信號通路目前,越來越多的研究證實CSCs帶有異常的表觀遺傳學修飾,這些修飾通過影響Wnt/b-catenin、Hedgehog、Notch和TGF-b/BMP信號通路,調控CSC的自我更新和分化能力,表現為腫瘤生長、惡性程度、轉移、復發及抗藥的改變。3.1dnnt1在cscs表達的調控CD133是CSCs的重要標志基因之一,由于高表達于CSCs,故可將腫瘤細胞區分為CD133+的CSCs和CD133-的non-CSCs。CD133基因在CSCs和non-CSC之間的表達差異與DNA甲基化相關:在CSCs中,CD133基因啟動子區DNA低甲基化,基因表達激活,而在non-CSC中,該基因則呈現出DNA高甲基化,表達抑制。最有趣的是,這種由DNA甲基化引起的CD133表達量的變化是可逆的,也就是說,CD133+細胞和CD133-細胞之間可以相互轉化,而現有的研究也證實,腫瘤中確實存在CSCs的動態變化,這就提示我們,CSCs和non-CSC并沒有絕對的嚴格界限,二者都只是腫瘤細胞某種特定的功能狀態,而表觀遺傳學是CSCs可塑性動態調控的基礎。目前觀點認為,特定基因的DNA甲基化在維持祖細胞的增殖、分化中發揮重要作用,也是CSCs表達干性的基礎,其中,DNMT1調節DNA甲基化從頭合成的酶,對于維持CSCs的特性最為關鍵。Sen等觀察細胞分化的過程,發現DNMT1富集在未分化的細胞中,且去除DNMT1可導致細胞提前進入分化,脫離祖細胞狀態,表明DNMT1能保持細胞的增殖能力,同時抑制分化;通過全基因組分析,DNMT1相關基因UHRF1及Gadd45A/B在調節細胞增殖、分化中的關鍵的作用,使細胞增殖時分化基因的啟動子呈DNA高甲基化,而當細胞向分化發展時,則伴隨著分化基因的DNA去甲基化,為DNMT1維持細胞增殖、抑制細胞分化提供了強有力的依據。隨后,Trowbridge等通過條件性敲除DNMT1的小鼠模型,發現DNMT1單倍劑量不足可阻礙淋巴瘤的進展,指出DNMT1表達缺失通過改變淋巴瘤干細胞(LSC)抑癌基因的DNA甲基化模式,并抑制相關的染色質共同修飾,損傷LSC的增殖,致癌能力減弱,從而抑制淋巴瘤。另一方面,通過藥物抑制DNMT1的功能,對腫瘤干細胞特性也產生了相似的效果。Marquardt等用ZEB處理肝癌細胞后,腫瘤中CSCs比例降低,且自我增殖及致瘤能力減弱;Tsai等在淋巴瘤和乳腺癌中也得到了相同結果,當給予低劑量DNA去甲基化制劑AZA(Azacitidine)或DAC(Decitabine)后,發現關鍵調節通路的基因甲基化狀態改變,CSCs數量降低,小鼠存活時間延長,從反面證明DNMT1的存在是維持CSCs所必須的。關于DNMT1維持CSCs干性的機制,目前研究認為,DNMT1在CSCs中作用的靶點主要包括抑癌基因、分化相關基因、干性相關通路基因。其中,BMP通路是促進干細胞分化、調控細胞干性的關鍵通路之一,膠質母細胞瘤CSCs中,BMP受體BMP1B由于基因啟動子區高甲基化而表達沉默,抑制BMP通路,從而維持CSCs低分化、惡性高、預后差的特性,且BMP1B同時受EZH2介導的抑制性組蛋白修飾,協同抑制CSCs的分化通路。此外,WNT通路可體現CSCs的功能狀態,deSousaEMeloF等發現,WNT通路靶基因啟動子的高甲基化常導致結腸癌的復發,“干性”增強,暗示WNT通路參與DNMT對CSCs的調控。3.2cscs的激活PcGs(Polycombgroupproteins)是催化組蛋白抑制性修飾的重要蛋白,主要由PRC1和PRC2復合物組成,PRC2的活性亞基EZH2催化組蛋白形成H3K9me和H3K27me,而PRC1的活性亞基BMI1催化組蛋白形成H2AUbiq(泛素化),二者同時發揮沉默基因的作用。研究表明,PcG復合物在維持CSCs的干性表型中發揮廣泛而重要的作用。在EZH2基因敲入小鼠模型中,通過誘導造血干細胞的EZH2表達,促進骨髓增生異常綜合征,體現了EZH2對干細胞增殖能力的影響;在T細胞淋巴瘤、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、結腸癌等多種腫瘤中,上調EZH2的表達水平,可直接檢測到CSCs數量的增多[40~44],而藥物阻斷或下調EZH2,則會導致CSCs自我增殖能力減弱,表面標記減少,致瘤能力受到抑制。類似的,PcG的另一個亞基BMI1,其表達水平與CSCs的干性也呈正相關。惡性程度高的腫瘤常伴隨高水平的BMI1,可促進CSCs的自我增值能力,而人為敲除BMI1基因使其表達下調,則阻礙了CSC的克隆形成能力,使腫瘤的形成受到抑制。此外,組蛋白甲基轉移酶MLL1在CSCs中的表達量也遠高于non-CSC,且當下調MLL1時會抑制HIF2a及其他相關基因表達,使CSCs的自我增殖和致瘤能力減弱。這些結果指出,抑制性組蛋白修飾與維持CSCs干性表型的具有一致性。另一方面,調控激活性組蛋白修飾H3K4me3也可影響CSCs的干性表型。LSD1/KDM1是組蛋白去甲基化酶,可消除組蛋白的H3K4me3修飾,使原來活化的基因表達沉默。通過給予LSD1抑制劑,使H3K4me3修飾水平升高,活化基因,可抑制多能腫瘤細胞的增殖,表現為CSCs干性減弱,這一結果在畸胎瘤、胚胎癌及精原細胞瘤中都得到了驗證。組蛋白修飾主要通過調控細胞分化增殖中的重要信號通路,影響CSCs的特性。哺乳動物腫瘤的全基因組測序結果顯示,WNT基因上的EZH2和H3K27me3修飾水平升高,而EZH2過表達可使WNT拮抗劑DACT3的基因轉錄抑制,激活腫瘤細胞的WNT/b-catenin通路,造成管內上皮增生,維持CSCs的自我更新能力;相反,使用小分子抑制劑阻斷EZH2時,則可顯著抑制腫瘤增殖。此外,神經母細胞瘤中EZH2通過誘導BMP受體BMPR1B表達沉默,下調BMP通路,抑制BMP2/4介導的細胞分化,從而使CSCs維持在低分化水平。3.3mir在cscs治療的作用染色質重塑蛋白SNF5可通過與靶基因啟動子區相互作用,改變DNA構象,從而影響Hh通路功能蛋白與啟動子的相互作用,當SNF5高表達時,Gli與啟動子接近受阻,抑制Hh通路調控干細胞和祖細胞增殖的功能;人惡性rhabdiod腫瘤中,SNF5失活,表達減少,Gli與靶基因相互作用增強,從而促進CSCs的增殖。此外,miRNA也是調控CSCs特性的重要表觀遺傳學機制。CSCs中表達減少的miRNA稱為抑癌性miRNA,可負性調節CSCs的自我增殖和致瘤能力,抑制干性。例如,研究發現,在多種腫瘤中低水平的Let-7常與腫瘤的惡性進展相關。前列腺CSCs的let-7水平顯著低于non-CSC,當人為上調let-7表達時,發現細胞分化程度增加,CSCs的自我增殖及致癌能力減弱;更有趣的是,發現let-7的下降與EZH2高表達協同出現,而上調let-7的表達則會引起EZH2表達減少,同時出現CSCs自我增殖能力被抑制,表明let-7的下調和EZH2的上調共同維持CSCs的干性。此外,miR-200b和miR-200c也可負性調節CSCs的特性,乳腺癌中miR-200b和miR-200c的升高會導致CSCs增殖和致瘤能力的減弱,而下調miR-200b和miR-200c,則可引起BMI1、Suz12及H3K27me的上調,促進CSC的干性功能,再次證實了miR與組蛋白修飾間的協同效應。研究還發現了另一個抑癌性miRNA—miR-34a,在前列腺癌、乳腺癌及胰腺癌等惡性腫瘤的CSCs中,miR-34a都呈現為低表達水平,且胰腺癌中低表達的miR-3