替米考星hplc測定方法的改進

氨基葡萄糖的化學名稱為4a-o-脫（2、6-二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧基）。20世紀80年代，美國麗來公司用半合成泰樂菌素來生產大環內酯類動物。替米考星由順式、反式和順-8-差向異構3種異構體混合而成,分子式C46H80N2O13,相對分子質量869.15。替米考星對革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌、支原體、螺旋體等均有抑制作用。替米考星比泰樂菌素有更強的抗菌活性,臨床用于由敏感菌引起的畜禽呼吸道感染,如家畜放線桿菌性胸膜肺炎、巴氏桿菌病、畜禽支原體病以及泌乳動物乳房炎的防治。另外,替米考星作為飼料添加劑連續使用14d可用于防治由放線桿菌和巴氏桿菌引起的豬細菌性肺炎。在替米考星含量測定中,美國藥典采用梯度洗脫HPLC法,該方法費時、乙腈用量高、不易操作。我國《獸藥質量標準》中替米考星的HPLC法不穩定,典型的表現有:順式、反式替米考星峰的分離度不穩定;順式峰有時有拖尾現象;在順式替米考星的峰后有時會出現順-8-差向異構體;反式峰的前面易出現雜峰。本文擬通過改變流動相的比例、稀釋液pH值等,改進替米考星HPLC含量測定方法,通過考察溶液放置時間、光照等因素,確定減小順-8-差向異構體峰面積的主要因素,為建立準確度高、精密度好的質量檢測標準提供試驗依據。1材料和方法1.1拜克公司的材料替米考星標準品(批號K0710305,含量90.3%)購自中國藥品生物制品檢定所;替米考星原料(批號08051501,含量85.5%)購自浙江升華拜克公司;乙腈(色譜純)、四氫呋喃(色譜純)、磷酸二丁胺均為天津科密歐化學試劑有限公司產品;高效液相色譜儀、紫外檢測器均為日本島津產品;ODS柱色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)為大連依利特公司生產;N2000色譜工作站為浙江大學智達信息工程有限公司產品。1.2溶液的制備1.2.1%磷酸溶液純化·mL-1)的配制將10mL磷酸(體積分數為85%)緩慢地加到50mL純化水中,定容至100mL,配制成10%磷酸溶液。將10%磷酸溶液70mL加到16.8mL二丁胺中,邊加邊攪拌,待溶液冷卻至室溫,用85%磷酸調節pH至2.5,加超純水定容至100mL。1.2.2稀釋劑的制備將5.7mL磷酸(85%)加入1000mL超純水中,用100g·L-1的NaOH溶液調節pH至2.5,密封保存。1.2.3乙腈溶液的配制·mL-1)的配制精確稱取25mg替米考星至50mL的容量瓶中,先加入10mL乙腈溶解,然后用稀釋液定容至50mL,再以0.22μm有機濾膜過濾備用。1.3測試方法1.3.1條件1用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充材料,檢測波長280nm,流速1mL·min-1,柱溫25℃,進樣量20μL。1.3.2緩沖液和流動相的測定在1000mL流動相中,乙腈含量由115mL梯度降至110、105、100和80mL,四氫呋喃、磷酸鹽(PBS)緩沖液均為50mL,其他為超純水。流動相以0.45μm有機濾膜過濾,超聲10min后使用。精確量取替米考星待測液20μL進樣,分別用5種流動相檢測,分析色譜峰和各項參數。1.3.3流動相ph按照乙腈、四氫呋喃、磷酸鹽緩沖液、超純水體積比為10∶5∶5∶80配制1000mL流動相,輔以100g·L-1NaOH溶液調節pH至2.75、2.68、2.50,以0.44μm有機濾膜過濾,超聲10min,其他條件不變。精確量取替米考星待測液20μL進樣,分別檢測并分析各項參數。1.3.4ph值的確定將5.7mL磷酸加入到1000mL的超純水中,配制4份,分別用100g·L-1NaOH溶液調節pH值,得到pH值為1.5、2.0、3.0、4.0的4種稀釋液,密封保存備用。精確稱取替米考星原料25mg4份分別置于50mL的容量瓶中,先加入10mL乙腈,再以配制好的不同pH值的稀釋液進一步定容至50mL。以0.22μm有機濾膜過濾,進樣,分別進行檢測并分析各項參數,評價反式異構體和順式異構體峰,計算所得回收率。1.3.5有機濾膜的制備精確稱取替米考星原料25mg于50mL容量瓶中,首先加入10mL乙腈進行溶解,再以pH2.5稀釋液定容至50mL。過0.22μm有機濾膜后分裝至西林瓶中,置于光照條件下分別進行5d和10d的處理,同時設立避光組作為對照。進樣,分別進行檢測并分析各項參數,評價反式異構體和順式異構體峰,計算所得回收率。1.3.6回收率、重復性試驗加樣回收試驗:精確稱取替米考星原料6份(各0.05g),置100mL容量瓶中,分別加入替米考星對照品0、10、20、25、30和50mg,加適量提取液使其溶解,并定容。按樣品含量測定方法處理分析,計算加樣回收率。重復性試驗:配制3種濃度的替米考星對照品溶液(每1mL分別含替米考星0.3、0.5、0.8mg),分別進樣,記錄峰面積值,計算相對標準偏差。中間精密度試驗:精確稱取替米考星原料3份(各0.05g),按照試驗中建立的方法,由不同操作者使用不同儀器、于不同時間測定并計算含量,計算相對標準偏差。1.4數據分析用統計軟件SPSS17.0進行LSD方差分析和差異顯著性檢驗,數據均以xˉ±SExˉ±SE表示。2結果與分析2.1乙腈含量的影響試驗結果(表1)顯示,在1000mL流動相中乙腈含量分別為105、100和80mL的情況下,反式替米考星峰與順式替米考星峰的分離度并無差異,但乙腈含量在115mL和110mL時其分離度差異極顯著。乙腈含量為105mL的試驗組與乙腈含量為110mL的試驗組無顯著差異,但與115mL組差異極顯著。結果顯示隨著乙腈含量的升高,其分離度逐漸降低。順式替米考星的拖尾因子在流動相中乙腈含量分別為80、105、100、110mL時差異極顯著,而且隨著乙腈含量的增加,拖尾因子有逐漸升高的趨勢。順式替米考星的理論塔板數在乙腈含量為100mL時最大,與其他試驗組皆存在顯著差異。由此可見,在每1000mL流動相中乙腈含量為100mL時,替米考星在HPLC測定中的各項參數達到最優狀態。2.2流動相ph值對拖尾因子分離度的影響從流動相pH值對替米考星分離效果影響的試驗結果(表2)可以看出,當流動相pH值為2.50和2.68時,反式替米考星峰與順式替米考星峰的分離度沒有差異,但在流動相pH值為2.50和2.68時,分離度都極顯著大于pH2.75和2.80時分離度,且pH2.75和2.80時的分離度差異極顯著;在拖尾因子參數中,流動相pH值為2.50、2.68、2.75和2.80時的拖尾因子值差異顯著;在順式峰理論塔板數中,流動相pH值為2.50和2.68時顯著大于流動相pH值為2.75和2.80時的。由此可以確定,在流動相pH值為2.50時,替米考星原料在高效液相色譜法測定中的各項參數達到最優(圖1)。2.3不同ph值對拖尾因子和順式峰理論塔板數的影響表3顯示,與對照相比,稀釋液pH值為2.0和4.0時分離度無顯著差異,但是pH值為1.5、2.0、3.0時分離度顯著降低;稀釋液pH值為1.5、2.0、2.5和3.0時拖尾因子與對照組相比差異顯著或極顯著,不過,稀釋液pH值對順式峰的理論塔板數無顯著影響,對照組順式峰的理論塔板數與pH值分別為1.5、2.0、3.0和4.0時無顯著差異。分析稀釋液pH值對替米考星回收率的影響發現,對照組替米考星回收率與稀釋液pH值為1.5時無顯著差異,但pH值為1.5時的回收率與pH值為2.0、2.5、4.0時存在顯著(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01),且此時回收率最高。2.4光照對回收率的影響表4結果顯示,對照組與避光5d組的分離度差異不顯著,且光照5d組與避光5d組的分離度無顯著差異,但對照組與光照5d組存在顯著差異;光照5d組的拖尾因子與避光組和對照組差異顯著,但對照組與避光5d組之間的拖尾因子無顯著差異;光照5d組與避光5d組的順式峰理論塔板數沒有顯著差異,但與對照組相比則差異顯著;避光組與對照組的回收率無顯著差異,但此兩組與光照5d組的差異極顯著,說明光照對反式替米考星含量分離度和反式替米考星的回收率影響很大,能明顯降低順式和反式替米考星的含量。光照10d組的分離度與避光10d組無顯著差異,避光10d組與對照組的分離度存在顯著差異,避光10d組與對照組差異不顯著,以光照10d組的分離度為最大;光照10d組的順式峰理論塔板數與對照組和避光10d組差異極顯著,而對照組與避光組無顯著差異;避光10d組與對照組的回收率無顯著差異,而避光10d組與對照組的回收率均與光照10d組差異顯著,而且極顯著地高于光照10d組(表4)。從表4還可以看出,對照組的回收率極顯著高于光照5d組和光照10d組,而光照5d組又顯著高于光照10d組;對照組、避光5d組和避光10d組等3組間的回收率無顯著差異。說明在避光條件下不影響反式替米考星和順式替米考星的穩定性。2.5回收率和重復性實驗采用優化后的色譜條件,加樣回收試驗結果(表5)顯示,方法的相對標準偏差(RSD)為1.61%,說明此方法的回收率高,準確度好。重復性實驗結果(表略)顯示,0.3、0.5和0.8mg·mL-13種濃度梯度下替米考星的RSD值分別為1.17%、0.74%和1.15%,均小于2%,方法重現性好。分別由不同操作者使用不同儀器于不同時間條件下進行的中間精密度試驗結果(表略)顯示,本方法的中間精密度較好。3稀釋液ph值的影響從本試驗結果可以看出,每1000mL流動相中乙腈含量為100mL時,替米考星的順、反式峰的分離度均為最高,而且隨著乙腈含量的增加,其分離度逐漸降低,說明乙腈在流動相中所占的比例能反向地影響替米考星順、反式峰的分離度。隨著乙腈含量的增加,拖尾因子的值逐漸增大,而順式替米考星峰理論塔板數逐漸降低。另外,隨著流動相pH值的增加,參數中拖尾因子逐漸升高,而順、反式異構體峰的分離度和順式峰理論塔板數逐漸降低。說明常用的ODS柱雖然具有一定的pH值適用范圍,