芹菜素對苯腎上腺素大鼠血管的舒張作用

通過植物提取的植物化學物質已成為當前研究的一個新方向。芹菜素屬植物黃酮類物質,具有降壓、抗炎等多種功效。體外血管環試驗表明,芹菜素能夠抑制電壓操縱性和受體操縱性鈣通道而抑制鈣內流。離體血管環實驗是研究血管生理學和藥理學的重要手段。本研究利用大鼠離體胸主動脈環灌流技術,結合利用各種阻斷劑,研究芹菜素舒張血管作用與內皮、鉀通道、鈣通道的關系,以期發現芹菜素舒張血管作用的可能機制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1g新興產品清潔級雄性Wistar大鼠,體重300~350g(中國人民解放軍軍事醫學科學院試驗動物中心),許可證號:SCXK-(軍)2007-004。1.1.2藥物、試劑和儀器芹菜素(apigenin)、L-N-硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-argininemethylester,L-NAME)、亞甲藍(methyleneblue,MB)、吲哚美辛(indomethacin,INDO)、四乙氨(tetrathylamonium,TEA)、氯化鈣(BaCl2)、4-氨基吡啶(4-aminopyrimide,4-AP)、格列苯脲(glibenclamide)、5-羥基癸酸(5-hydroxydecanoate,5-HD)、乙酰膽堿(Ach)、苯腎上腺素(phenylephrine,PE)均購自Sigma公司。格列苯脲、吲哚美辛和芹菜素均用DMSO溶解,TEA和4-AP用生理鹽水溶解、其他試劑用蒸餾水溶解。預實驗證明,DMSO的體積分數小于0.2%對血管的收縮沒有影響。1.1.3pac、張力換能器、數控超級恒溫槽BIO-PAC生物信號采集處理系統(美國BIO-PAC公司生產,MP150),張力換能器、數控超級恒溫槽(西班牙PanLab公司生產,LE01086Automaticorganbath)。1.2方法1.2.1kreb內移植成血管大鼠胸主動脈環的制備參考文獻并略加改進。腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,迅速游離大鼠胸主動脈,置于4℃含95%O2和5%CO2混合氣體預飽和的Kreb液中,剔除周圍結締組織,剪成3~4mm的血管環。據實驗需要,采用棉簽磨擦血管環內表面的方法,將部分血管環制備成去除內皮的模型。1.2.2企業和八通道前置裝置不同時長系統調零后,將血管環固定懸掛于一對L型不銹鋼絲彎夾上并置于浴槽內。懸掛血管環上方的不銹鋼絲與張力換能器相連。張力換能器連接主機以及八通道前置附帶裝置。懸掛張力的變化通過計算機顯示并由BIO-PAC計算機軟件(ACKNOWLEDGE4.0)記錄保存。浴槽的溫度通過管道由超級恒溫器控制在37℃恒溫。保持浴槽中的Kreb液在20ml,并持續小劑量通入含95%O2和5%CO2的混合氣體。血管環懸掛在張力換能器上后,調節前負荷為2.0g,平衡60min,期間每15min換液一次,并保持浴槽中液體的量穩定在20ml。1.2.3血管內皮完整性測定用KCl60mmol/L重復刺激3次,以誘發血管的最大收縮幅度。待血管環重新穩定后,用1μmol/LPE收縮血管環達峰值,加入10μmol/LAch檢驗血管內皮完整性。若加Ach后使PE預收縮的血管環舒張60%以上,可認為內皮完整;反之,則認為內皮去除。已完全去內皮的血管,用Ach后不產生舒張。1.2.4試驗設計1.2.4.1.芹菜素對血管環的直接影響取去內皮和內皮完整的血管環,以累積加藥法依次加入芹菜素(1、3、10、30μmol/L),觀察血管環張力的改變。1.2.4.駁岸中紫菜素的量效試驗取去內皮和內皮完整的血管環,分別以1μmol/LPE預收縮血管環,在達到坪值后,以累積加藥法依次加入芹菜素(1、3、10、30μmol/L),給藥間隔約10min,記錄芹菜素作用的量效曲線,并計算最大效應(maximumeffect,Emax)以及芹菜素引起血管環達到Emax的50%效應時的濃度(EC50)。1.2.4.菜素量效曲線測定取內皮完整血管,在浴槽中加入L-NAME(100μmol/L)、MB(10μmol/L)、INDO(10μmol/L)于37℃孵育20min,加入1μmol/LPE,在收縮達到坪值后,以累積加藥法依次加入芹菜素(1、3、10和30μmol/L),記錄芹菜素作用的量效曲線。1.2.4.菜素量效試驗取無內皮血管,在浴槽中加入TEA(5mmol/L)、BaCl2(100μmol/L)、4-AP(100μmol/L)、格列苯脲(10μmol/L),5-HD(100μmol/L)于37℃孵育20min,加入1μmol/LPE,在收縮達到坪值后,以累積加藥法依次加入芹菜素(1、3、10和30μmol/L),記錄芹菜素作用的量效曲線。1.2.4.從無鉀環境下駁岸對pe收縮的影響(1)與電壓依賴性鈣通道的關系:觀察芹菜素對去內皮血管由高鉀(60mmol/L)引起血管張力的變化。(2)與受體操作性鈣通道的關系:去內皮血管,用無鉀液沖洗4~5次,加1μmol/LPE,達到收縮平臺后,采用累計加藥法加入芹菜素(1、3、10和30μmol/L),觀察無鉀環境下芹菜素對PE收縮的影響。(3)與細胞外鈣內流的關系:去內皮的血管,用無鈣液沖洗4~5次,加入PE至收縮穩定后,按濃度遞增的方式加入CaCl2,比較有或無芹菜素(30μmol/L)(加PE前與血管環預孵育20min)存在時,血管張力隨鈣濃度的變化情況。1.3血管張力檢測所有數據用表示,統計學分析采用SPSS15.0分析軟件。以PE1μmol/L誘發最大收縮幅度為100%,以加入藥物后的血管張力幅度與PE誘發最大收縮幅度之間的比率反映血管張力的變化。所有數據均通過正態性檢驗,采用獨立樣本t檢驗進行分析,以P<0.05為差異有顯著性。舒張百分比的計算公式為:2結果2.1蔡氏辛酯對血管環張力的影響分別取去內皮和內皮完整的血管環,以累積加藥法加入芹菜素,在本試驗劑量內,血管環的張力并無明顯改變,提示芹菜素不影響血管環的靜息張力。2.2血管張力的變化由圖1可見,芹菜素在有或無內皮的血管上均可劑量依賴性地減小PE預收縮血管張力,但是在內皮完整的血管上,這一作用顯著大于去內皮血管(P<0.01)。內皮完整組的Emax=76%,EC50=4.55μmol/L,而去內皮組的Emax=44%,EC50=48.4μmol/L。2.3內皮完整的血管從圖2可以看出,預先給予INDO并不能抑制芹菜素引發的血管舒張作用。從圖3可以看出,用L-NAME孵育內皮完整的血管環后,可明顯抑制芹菜素引發的血管舒張,與未經L-NAME處理的內皮完整組相比,存在顯著差異(P<0.01)。從圖4可以看出,在有內皮的血管環模型上,MB可以顯著降低芹菜素對PE預收縮血管的舒張作用。2.4tp、bacl2抑制劑的作用機制從表1可以看出,電壓敏感型K+通道(Kv)抑制劑4-AP、線粒體ATP敏感K+通道(KATP)抑制劑5-HD、Ca2+激活的K+通道(KCa)抑制劑TEA、內向整流型鉀通道(KIR)抑制劑BaCl2均能顯著抑制芹菜素對PE預收縮去內皮血管的舒張作用(P<0.05)。而非特異KATP抑制劑格列苯脲對芹菜素舒張血管的作用則沒有影響(P>0.05)。2.5菜素在血管管作用中的應用從表2可以看出,在無鉀環境下芹菜素對PE引起的血管環收縮有顯著抑制作用,推測芹菜素的舒血管作用可能涉及對細胞內鈣釋放或對受體操縱性鈣通道的阻斷作用。芹菜素對高鉀引起的血管收縮具有顯著的抑制作用,推測芹菜素的舒血管作用涉及到電壓依賴性鈣通道。從表3可以看出,無鈣環境下,當PE預收縮達平臺,再逐漸加入鈣,芹菜素可顯著降低加入Ca2+引起的血管張力的升高。3自由基因子nos抑制劑血管環模型試驗研究結果顯示,芹菜素可以濃度依賴性地抑制內皮完整及去內皮血管模型由PE引起的血管收縮,且在內皮完整血管上,芹菜素的舒血管作用顯著大于去內皮血管,提示芹菜素引起的血管舒張效應涉及到內皮依賴性和非內皮依賴性兩個途徑。在內皮完整血管,血管內皮細胞中的內皮型一氧化氮合酶(eNOS)可以催化左旋硝基精氨酸生成NO,NO進入血管平滑肌細胞,作用于可溶性鳥苷酸環化酶(solubleguanylatecyclase,sGC),引起cGMP的升高,導致血管舒張。后者主要通過cGMP依賴性蛋白激酶作用使鈣內流減少,增加鈣ATP酶對鈣的攝取或直接作用于收縮蛋白去磷酸化而使血管舒張。另一方面,NO可通過直接激活TEA敏感型鉀通道而發揮舒血管作用。一氧化氮合酶(NOS)抑制劑L-NAME,sGC抑制劑MB可以顯著削弱芹菜素的作用,推測芹菜素內皮依賴性血管舒張作用可能通過NO介途徑導,這與以往的研究結果相一致。本研究提示芹菜素對去內皮血管環模型也具有顯著的舒張作用,提示芹菜素還可能直接作用于血管平滑肌細胞引起血管舒張。血管平滑肌細胞鉀通道的開放,造成細胞膜超極化從而使血管舒張,這在血管舒張中占有重要作用。激活血管平滑肌上的K+通道,往往引起細胞膜超極化,從而抑制細胞外鈣內流,引起血管舒張。血管平滑肌上主要存在4種K+通道:ATP敏感K+通道(KATP),Ca2+激活的K+通道(KCa),電壓敏感型K+通道(Kv)和內向整流型K+通道(KIR),格列苯脲為KATP非特異性抑制劑,5-HD為線粒體敏感KATP抑制劑(mito-KATP),TEA、4-AP、BaCl2分別為KCa、Kv、KIR的抑制劑。本研究顯示,4種抑制劑(TEA、4-AP、BaCl2、5-HD)均可顯著減弱去內皮血管環模型芹菜素的血管舒張作用,提示芹菜素的血管舒張作用可能還與其激活K+通道有關。然而,CALDERONE等認為KCa可能并未參與芹菜素的血管舒張,確切的原因有待進一步研究。血管平滑肌細胞內Ca2+含量的變化是血管進行收縮和舒張的關鍵性因素。血管平滑肌細胞膜上存在電壓依賴性鈣通道(VDC)及受體操縱性鈣通道(ROC),他們分別被高鉀和PE激活。高鉀主要是引起平滑肌細胞去極化,激活細胞膜上的VDC,引起細胞外鈣離子內流,產生收縮,同時細胞外鈣離子的內流也誘導了細胞內雷諾丁(ryanodine)敏感鈣池的鈣釋放,即所謂的鈣誘導的鈣釋放(CICR),升高細胞內鈣,增強血管平滑肌收縮。本實驗發現芹菜素對高鉀引起的血管收縮具有明顯抑制作用,提示芹菜素可能通過減少KCl誘導的VDC內流而發揮其舒張血管的作用。PE則可通