ICS

65.020.30CCS

B

416540

DB

6540/T

馬紅球菌

PCR

檢測方法PCR

test

method

for

streptococcus

equi

發布

實施伊犁哈薩克自治州市場監督管理局 發

布DB

6540/T

022— 本文件按照GB/T

《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。本文件由昭蘇縣西域馬業有限責任公司提出。本文件由伊犁州畜牧獸醫局歸口并組織實施。控制與診斷中心、新疆農業職業技術學院、尼勒克縣胡吉爾臺鄉畜牧業發展中心。本文件主要起草人：馬玉輝、呂燕、李海、趙紅瓊、劉璐、余萬里、余海、葉斯哈提·胡安、蘆文軍、蔡鵬、蔡濤、顧偉芳、雷艷、倪艷、江阿拜?居瑪德勒汗。DB

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022—

PCR

1 范圍本文件規定了馬紅球菌的檢測方法。本文件適用于馬匹上呼吸道滲出物（鼻拭子）及糞便（肛拭子）樣本中馬紅球菌的檢測。2 規范性引用文件文件。GB/T

分析實驗室用水規格和試驗方法GB

19489 實驗室

生物安全通用要求NY/T

獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規范3 術語和定義下列術語和定義適用于本文件。馬紅球菌 rhodococcus

equi,

R.

屬放線菌目、諾卡菌科、紅球菌屬。該菌是一種革蘭陽性兼性胞內寄生球桿菌，耐酸，無孢子，大多無鞭毛。R.

equi可以在肺泡巨噬細胞中存活并復制，導致不同動物物種和人發生肺部和肺外化膿肉芽腫感染。聚合酶鏈式反應

chain

reaction,

體外酶催化合成特異DNADNA聚合酶作用和適宜的反應條件下，根據模板序列設計的兩條引物分別與模板兩條鏈上相應的一段互補序列退火而相互結合，接著在DNA聚合酶的作用下以4種dNTPs為底物，使引物得以延伸，然后不斷重復變性、退火和延伸這一循環，使欲擴增的基因片段以幾何倍數擴增。4 縮略語下列縮略語適用于本文件。R.

：馬紅球菌

equi)ChoE：膽固醇氧化酶

VapA：毒力相關脂蛋白

DNA：脫氧核糖核酸

(Desoxyribonucleic

acid)PCR：聚合酶鏈式反應

chain

dNTP：脫氧核苷酸三磷酸

(Deoxynucleotide

ddH2O：雙蒸水

(Double

distilled

bpVapA

569

ChoE

957

DB

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022—Taq：水生棲熱菌

aquaticu)5 生物安全措施GB

19489中的有關規定進行。6 診斷方法主要設備、試劑及耗材冰箱、速冷凍離心機、恒溫水浴鍋、混勻器、高壓滅菌器、電子天平、PCR儀、電泳儀、凝膠成像10

μL，

μL，

μL

μL，100

μL，

μL管、一次性使用采樣器（拭子）、50%（體積比）甘油、胰酪大豆胨瓊脂培養基、胰蛋白胨大豆肉湯、細菌基因組提取試劑盒、緩沖液、瓊脂糖、電泳緩沖液、溴化乙錠、DNA

ladder、PCR擴增相關試劑（詳見附錄A）。樣本采集、保存6.2.1 樣本采集器具采樣器具為一次性無菌產品，一套清潔采樣工具僅限一個樣本使用。存放樣本的容器應清洗干凈，121

℃

20

min滅菌后使用，或為一次性使用無菌容器。6.2.2 樣本采集步驟8

cm～10

，肛門深度約為3

cm～5

cm），輕輕旋轉棉拭子不少于3圈，抽出棉拭子，將拭子樣品端置于含有1

mL甘油肉湯的無菌2

mL離心管中，室溫條件下

h內運送至實驗室，2

℃～8

℃條件下3

d內運送至實驗室。如樣本不能及時送達實驗室，應置于-20

℃以下長時間保存。6.2.3 核酸提取30NMNAT鑒別培養基上， ℃30培養48

h，觀察菌生長情況。挑取生長成灰黑色粘稠樣的單菌落，使用細菌基因組取細菌基因組，置于

℃待檢。檢測方法6.3.1 引物序列表1表1 引物列表DB

6540/T

022—6.3.2 PCR

擴增體系6.3.2.1PCR

μL2×Taq

Master

，

μL；ddH2O，8.5

μL1

μL（0.5

μM）；下游引物，1

μL（

μM）；模板，2

μL。6.3.2.2 PCR

反應程序：94

℃預變性

5

min；94

℃變性

s，55

℃退火

30

s，72

℃延伸

s，個循環；

℃延伸

10

，4

℃保存。

反應循環參數可根據基因擴增儀型號的不同進行適當調整.6.3.2.3 ATCC

33701

致病性

equi

6939非致病性

equi

標準菌株）。6.3.3 PCR

產物電泳檢測用1×TAE電泳緩沖液配制的瓊脂糖（含100

μl/L熒光染料），在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛好沒過膠面，將5

μL

PCR產物加入樣品孔內，電泳時以DL

Marker

作為參照，5

V/cm電泳約30

；凝膠成像儀下觀察電泳結果，拍照并記錄結果。結果判定致病性R.

PCR產物為957

bp及

bp兩條條帶。6.4.1 PCR

檢測試驗成立判定DNA

marker957

bp和569

bp大小的兩條目標擴增條帶；陰性對照電泳道僅出現約

大小的一條目標擴增條帶，參見附錄B中圖，則試驗成立。否則，試驗不成立。6.4.2 PCR

檢測結果判定在6.4.1成立的基礎上，判定檢測結果：被檢樣品泳道擴增到約

bp和569

大小的兩條目的條帶，則判定為致病性R.

核酸陽性，見附錄B中圖B.2泳道1；被檢樣品泳道僅擴增到約957

bp大小的R.

B中圖泳道2未出現，則判定為R.

equi核酸檢測陰性。6.4.3確證試驗將提取的細菌基因組DNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司及杭州有康生物科技有限公司委托完成基因組16S

rRNA的一代測序，將序列進行拼接比對，比對結果為R.

，則表明檢測結果為陽性，該樣本中存在R.

equi。廢棄物處理和防止污染的措施檢驗過程中的廢棄物，收集后統一高壓滅菌處理。DB

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022—

附 錄 A（規范性）PCR

診斷用主要試劑溶液配方A.1 TE

緩沖液（pH=8.0)Tris（1

mol/L

pH

） 10

mLEDTA（0.5

mol/L

pH

8.0） 2

mL加水定容至1

L，121

℃高壓滅菌15

，4

℃保存即可。A.2 TAE

電泳液（50×）Tris 242.0

g冰乙酸 57.1

mLEDTA（0.5

mol/L

pH

8.0） 100.0

mLddH2O補充至 1.0

L使用時用去離子水稀釋至1×的電泳液。A.3 0.01

mol/L

溶液（

7.2

～

pH

7.4）NaCl 8.0

gKCL 0.2

gKH2PO4

gNa2HPO4·12H20

g使用

mL去離子水溶解，調節pH至7.2

~

，加水定容至1

L。

℃高壓滅菌15

min，室溫保存即可。A.4 1%瓊脂糖凝膠稱取1.0

g瓊脂糖，加入

mL電泳緩沖液加熱溶解，加入溴化乙錠溶液至終濃度為1

μg/mL，15

℃～25 ℃冷卻至固態，現配現用。A.5 NMNAT

培養基稱取培養基

g于1

L雙蒸水中，攪拌溶解，高壓滅菌20

，冷卻至50

~

60

℃。加入配制好的新生霉素，終濃度為25

μg/mL；放線菌酮，終濃度為40

μ；萘啶酸，終濃度為20

μ；亞碲酸鉀35

（100

mm4

℃貯存備用。DB

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022—

附 錄 B（規范性）馬紅球菌菌落形態及

PCR

檢測電泳圖B.1馬紅球菌菌落形態圖NMNAT鑒別培養基30

℃培養48

h，馬紅球菌菌落形態見圖B.1。圖B.1

馬紅球菌菌落形態B.2 樣本采集、核酸提取步驟馬紅球菌檢測結果電泳例圖見圖。說明：M—DL2000

Maker；1—致病性馬紅球菌（、VapA+）；2—非致病性馬紅球菌（、VapA-）。圖B.2

馬紅球菌

檢測電泳圖DB

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022—

附 錄 C（資料性）馬紅球菌基因擴增片段C.1 馬紅球菌

基因擴增片段（

bp）1

gtcaacaaca

ggtacaagtt

cgcccgcacc61

ggccgcaaga

tcgtgcccaa

cgtgtacgac121

ttcgagtaca

agtcgggcct

cggcggtgag181

gtcatctacg

agacctacct

cgcgcaggcc241

gcggccaccg

tcaccaaggt

cgcgccggcc301

accggcagcg

agcagggcaa

cgtcgtcgcc361

accaaggtcg

gcagcgtcgg

caccagcaag421

ctcctggtct

tgtcgtcgca

agtcggcgag481

ggctggggca

accacatgtg

ggacgccacc541

ggatccaagc

actgggccga

cccgacggca601

ccgatcttcg

agacctacgt

cagcctgtac661

ctggccatca

tcaattcggg

caccggcaag721

gtcgatctca

tcgacatggc

caagaaggtg781

ttcgacaaga

ccgatctgtt

cggcgtgtac841

aagacgtggg

gcgtgctgct

gaacaaggcg901

accgacaact

acgtggtgga

C.2 馬紅球菌

基因擴增片段（

bp）1

atgaagactc

ccacagccgt

agctgcggct61

gcggctatga

ttgattccgg

tagcagcagt121

gcgattctca

ctgggagcta

tgacagctcg181

acgacttcgt

gagcaagcga

taccgccggg241

c