1例抗凝血酶缺陷癥先證者及其家系遺傳分析

抗凝酶（at）是人體抗凝酶的主要因素之一。大約占抗凝酶系統(tǒng)總活性的70%，它可以誘導(dǎo)凝血酶、凝血酶和其他激活的凝血因子，如凝血酶和飽腹。遺傳性AT缺陷癥是一種常染色體顯性遺傳性疾病,為靜脈血栓形成的主要遺傳性危險因素之一。本文對1例遺傳性AT缺陷癥患者進行臨床表型診斷、家系調(diào)查、實驗診斷和基因診斷,發(fā)現(xiàn)了1種新的引起AT缺陷癥的模式,即同一等位基因復(fù)合雜合突變導(dǎo)致遺傳性AT缺陷癥。1數(shù)據(jù)和方法1.1髂總靜脈血栓形成史先證者,男,55歲,2010年8月因肺炎合并肺栓塞入院,靜脈造影顯示左髂總靜脈血栓形成。既往有反復(fù)下肢靜脈血栓形成史,45歲時首次發(fā)病,曾使用尿激酶溶栓治療3～4次。家族史陽性,其父40多歲時突發(fā)腦血管疾病去世;其兄、弟、妹均有反復(fù)下肢靜脈血栓形成史。其他家系成員沒有血栓形成事件發(fā)生。家系圖見圖1。1.2血漿c活性檢測Ag和AT:A及其他相關(guān)抗凝因子活性檢測先證者及家系成員分別用負(fù)壓靜脈采血1.8ml,1∶9枸櫞酸鈉抗凝,立即4℃、3000r/min離心10min后收集上層血漿。AT:Ag檢測采用免疫比濁法(美國BeckmanCoulter公司試劑盒,美國Array360儀器)。AT:A和蛋白C活性(PC:A)檢測采用發(fā)色底物法。蛋白S活性(PS:A)檢測采用凝固法(德國西門子公司試劑盒,日本Sysmex7000全自動血凝儀)。1.3各組dna提取先證者及其家系成員枸櫞酸鈉抗凝外周血,應(yīng)用天根生物科技(北京)有限公司DNA抽提試劑盒,嚴(yán)格按照說明書操作提取基因組DNA。1.4pcr引物信息使用Primer5引物設(shè)計軟件設(shè)計AT基因1、3、4、6和7號外顯子和側(cè)翼序列的擴增引物,2和5號外顯子序列參照文獻報道,引物信息見表1。PCR總體系為25μl∶1×緩沖液,dNTP終濃度為0.2mmol/L,引物終濃度為0.2μmol/L,Taq酶1.25u,模板DNA50ng。95℃預(yù)變性5min,然后95℃30s,62℃30s,72℃30s,32個循環(huán),最后72℃延伸10min。1.5pcr擴增和測序驗證PCR產(chǎn)物由北京六合華大基因科技公司純化和測序。測序圖采用Chromas軟件進行比對分析,突變序列經(jīng)反向測序證實。家系成員則僅在先證者中發(fā)現(xiàn)的AT基因突變區(qū)域進行PCR擴增和測序。針對先證者2個新的突變位點,對100名正常人DNA,PCR擴增相應(yīng)突變位點并測序,以排除基因多態(tài)性。2結(jié)果2.1ps蛋白和ps活性先證者AT:Ag和AT:A分別為114mg/L和54.8%,PC和PS活性分別為94.7%和91.9%。其家系成員相關(guān)檢測見表2。2.2編碼蛋白的arg、ser和agt對先證者AT基因7個外顯子及側(cè)翼序列的測序結(jié)果比對發(fā)現(xiàn),先證者AT基因第2外顯子區(qū)存在兩處變異,c.134G>A和c.342T>G(圖2),將分別導(dǎo)致編碼的AT蛋白Arg(CGG)被Gln(CAG)所替代(p.Arg13Gln)和Ser(AGT)被Arg(AGG)所取代(p.Ser82Arg)。對該家系其他8名成員的AT基因第2外顯子測序發(fā)現(xiàn),6名成員與先證者存在相同突變(表2)。2.3名婦人的相應(yīng)位點針對先證者AT基因的突變位點,通過測序100名健康人的相應(yīng)位點,未見相同變異,排除了突變位點為基因多態(tài)性的可能。經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索,c.134G>A和c.342T>G為新的突變位點。3i型遺傳at缺陷癥遺傳性AT缺陷癥是由于編碼AT蛋白的基因(SERPINC1)突變所引起的一種常染色體遺傳病,多為顯性遺傳,是靜脈血栓栓塞癥(venousthromboembolism,VTE)的主要遺傳性危險因素之一。遺傳性AT缺陷癥在人群中的發(fā)生率為2/104～5/104,而在VTE患者中的發(fā)生率高達1%～8%。遺傳性AT缺陷癥分2型:I型主要表現(xiàn)為AT抗原(AT:Ag)和活性(AT:A)的同步減少,Ⅱ型是由于AT結(jié)構(gòu)異常所致。本家系先證者有反復(fù)發(fā)作的血栓病史,其兄、弟、妹也有相似病史,其母AT的活性和抗原均正常,而其父40多歲時突發(fā)腦血管疾病去世。實驗室檢查先證者AT:A和AT:Ag為114mg/L和54.8%,均為參考值的50%左右,而PC:A和PS:A均正常?；驒z測結(jié)果顯示,AT基因第2外顯子存在兩處錯義突變,分別為c.134G>A和c.342T>G,其兄、弟、妹、1個侄子、兩個侄女均存在該兩種突變,故診斷為I型遺傳性AT缺陷癥。先證者及其三個兄、弟、妹均在40歲左右首次發(fā)病,而攜帶突變的3個子代均無血栓病史。VTE是一種多因素的疾病,包括遺傳性因素和獲得性因素,而年齡是最主要的獲得性危險因素。調(diào)查發(fā)現(xiàn),VTE的發(fā)病率隨年齡增長而顯著上升,兒童VTE的發(fā)病率為每年1/100000,而老年人(年齡>70歲)可高達1%,這也許是本家系Ⅲ1、Ⅲ3和Ⅲ4目前未表現(xiàn)VTE的主要原因。本家系先證者AT基因第2外顯子區(qū)存在兩處突變。由于攜帶突變的4名親代均在該兩處位點上發(fā)現(xiàn)相同的突變,且他們的子代或者是不存在任何突變,或者是存在兩種相同的突變,根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律之分離律推測,先證者的兩種突變位于同一條染色單體上,即兩種雜合突變來自于同一等位基因。純合子和復(fù)合雜合子I型AT缺陷癥患者往往不能存活,目前報道的純合子AT缺陷癥均為Ⅱ型。本例先證者雖然是復(fù)合雜合子I型AT缺陷癥,但因為兩處雜合突變只累及一條染色單體,另一條正常的染色單體可以合成AT,所以先證者仍然具有50%左右的AT:A和AT:Ag。這是一種新的引起Ⅰ型AT缺陷癥的模式。曾報道Ser82Asn引起的I型AT缺陷癥,對Ser82Asn進行表達研究后發(fā)現(xiàn),Ser82Asn導(dǎo)致AT在胞內(nèi)滯留,分泌減少,并認(rèn)為82位氨基酸額外糖基化可能會阻礙AT翻譯后的折疊,從而導(dǎo)致I