冠心病abca1基因多態(tài)性的研究

三磷腺苷配合箱戰(zhàn)艦子a1（pt-whys1）是一種完整的膜蛋白。這些以pt為能量，在逆膽固醇旋轉(zhuǎn)（rct）和高密度血脂（hdl）之間的初始階段發(fā)揮重要作用。他被稱為rct防守，并在抗動脈硬化方面發(fā)揮了作用。ABCA1基因的突變可以引起Tangier病(TD)和家族性HDL缺乏(familialhypoalphalipoprotein-emia,FHA),而ABCA1基因的一些常見的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms,SNP)對血脂、動脈粥樣硬化的產(chǎn)生和冠心病的嚴重程度也有很大的影響。本實驗組通過聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)結(jié)合DNA測序的方法對112例冠心病患者進行了ABCA1基因全部編碼區(qū)50個外顯子的檢測,發(fā)現(xiàn)一個國內(nèi)外尚未報道的新SNP位點,并對先證者進行了家系調(diào)查,同時還發(fā)現(xiàn)6個已報道的SNP位點,現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。數(shù)據(jù)和方法1.菌株年齡、性別分布均為漢族人,分為冠心病組及正常組。冠心病組:選取2004年9月至2005年8月廣州市南方醫(yī)院心內(nèi)科住院確診的冠心病患者112例,男79例,女33例,年齡(60.8±11.3)歲,其中行冠狀動脈造影確診55例,經(jīng)臨床癥狀結(jié)合心電圖、超聲心動圖、平板運動實驗及心肌灌注同位素發(fā)射計算機斷層顯像(ECT)表現(xiàn)證實57例。均排除嚴重肝、腎、腫瘤等疾病。正常組:108例,其中男性74例,女性34例,年齡(59.9±7.9)歲。經(jīng)詢問病史、體檢、實驗室檢查(血、尿、便常規(guī),血脂,血糖,肝、腎功能)、心電圖、胸片等檢查排除冠心病、高血壓、糖尿病、腫瘤和嚴重的肝、腎疾病。兩組年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。家系調(diào)查人群中先證者為冠心病組患者,其他家系人員不包括在冠心病組及正常組內(nèi)。2.提取氨基酸基因的dna外周靜脈血3ml,乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2)抗凝,用基因組DNA提取試劑盒(天為時代公司)提取基因組DNA。3.pcr擴增條件引物由上海英駿公司合成,擴增50個外顯子。PCR反應(yīng)體系25μl,含提取DNA1μl、10×Buffer2.5μl、Taq酶1.25U、2.5mmol/LdNTP2μl、10μmol/L上、下游引物各1μl。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性120s;94℃變性30s、55℃~62℃退火60s、72℃延伸60s,共35個循環(huán);72℃終末延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。4.mda的合成用PCR產(chǎn)物行SSCP檢查。以30%聚丙烯酰胺貯存液配成8%非變性聚丙烯酰胺凝膠,9μlPCR產(chǎn)物加入1μl10×堿變性液(50mmolNaOH,10mmolEDTA),在室溫變性10min后,再加入10μlLoadingBuffer(0.05%溴酚藍,0.05%二甲苯青藍,95%甲酰胺,0.5mol/LEDTANa2)于98℃變性10min后4℃驟冷上樣。4℃恒溫循環(huán)水條件下200V電泳14h左右。以10%冰醋酸固定15min,去離子水沖洗2~3次,0.2%硝酸銀染色15~20min,去離子水沖洗2~3次,再用3%氫氧化鈉(內(nèi)含0.005%甲醛)顯色至適度(信號強、背景淺),結(jié)果照相并干膠保存。5.ddntps法SSCP發(fā)現(xiàn)異常條帶的PCR樣本送至上海英駿公司,使用377測序儀采用4種ddNTPsDye-Terminators法,在同一反應(yīng)管中完成循環(huán)測序反應(yīng),再在同一電泳道中分離檢測。6.酶切位點設(shè)計SSCP及測序發(fā)現(xiàn)異常的樣本,在正常組行酶切檢查確定此改變是否為SNP,同時在冠心病組行酶切檢查并與正常組比較,明確其臨床意義。根據(jù)酶切位點設(shè)計新的引物序列:上游5′GCAAGGCTACCAGTTACATT3′;下游5′TGTCCAAGGAAAAGCCTCAC3′。CviAⅡ酶切反應(yīng)體系20μl,含PCR產(chǎn)物10μl、限制性內(nèi)切酶CviAⅡ0.5μl、10×緩沖液2μl、去離子水7μl。置于25℃恒溫水浴箱中16h,2%瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物為240bp,酶切后產(chǎn)物長度為146bp和94bp。結(jié)果1.s1292gm133v新位點112例冠心病患者ABCA1基因50個外顯子檢查發(fā)現(xiàn)1例患者外顯子7存在異常條帶(圖1),經(jīng)序列分析我們發(fā)現(xiàn)并證實了ABCA1基因外顯子7中新位點的改變(圖2),此新位點的改變?yōu)锳1092G;氨基酸改變?yōu)镸(甲硫氨酸)233V(纈氨酸)。108例正常人發(fā)現(xiàn)4例存在A1092G位點的改變,發(fā)生率為3.7%,112例冠心病患者發(fā)現(xiàn)2例存在A1092G位點的改變,發(fā)生率為1.8%,結(jié)果證實A1092G(M233V)新位點為SNP,但兩組間發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。我們同時證實中國人ABCA1基因也存在已報道的R219K、V771M、T774P、K776N、M883I、R1587KSNP位點(圖3)。2.陳舊性下壁心肌梗死先證者(編號1)為65歲男性,湖南籍。心電圖表現(xiàn)為Ⅱ、Ⅲ、aVF導(dǎo)聯(lián)典型異常Q波,胸前導(dǎo)聯(lián)ST-T改變。結(jié)合超聲心動圖等資料診斷為陳舊性下壁心肌梗死。其父母及兩個哥哥均已去世,其中一個哥哥死于心血管疾病,另外三人死因不詳。其一個姐姐(編號9)也存在基因改變,并也曾因陳舊性下壁心肌梗死入院治療,其他成員無明顯心血管疾病。其家系16人ABCA1基因外顯子7檢測共發(fā)現(xiàn)5例存在基因改變,分別為編號1、5、6、9、14的家族成員(圖4),占31.3%。3.責(zé)任指標(biāo)dl-c、極低密度膽固醇的tg、tg、tg、tg、tg、l-c、l-c、l-c、l-c、l-c、l-c、l-c、l-c、l-c、l-c、dl-c、dh-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-先證者(編號1)血脂水平表現(xiàn)為血漿總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)均增高,尤以TG增高明顯。先證者曾患心肌梗死的姐姐(編號9)TG增高,高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低,另一例(編號14)血脂五項中TG增高,另外四項指標(biāo)均正常。編號5患者,除LDL-C降低外,其余血脂指標(biāo)檢查均正常(表1)。ag型相關(guān)基因的基因型及突變?nèi)姿嵯佘战Y(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白超家族是ATP-bindingcassette(ABC)的簡稱,是一組利用ATP作為能源,在細胞間和細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運底物的蛋白質(zhì)。大多數(shù)ABC是膜蛋白,可以轉(zhuǎn)運多種物質(zhì):包括脂類、固醇、代謝物及跨越細胞內(nèi)膜及外膜的各種藥物。此家族成員數(shù)量繁多,底物多樣,其共同特點是都能結(jié)合并水解ATP,應(yīng)用釋放的能量轉(zhuǎn)運各種分子。ABCA1是ABC超家族中的一員。人類ABCA1基因定位于9q31,長度149kb,含有1453bp啟動子及50個外顯子,組成由2261個氨基酸組成的膜蛋白(圖3),相對分子質(zhì)量為254000,由兩個跨膜部分組成。ABCA1基因不同位點的突變引起TD或FHA,易早發(fā)動脈粥樣硬化、冠心病。這些突變可發(fā)生在ATP結(jié)合區(qū)、N末端編碼序列等處。已證明ABCA1主要功能是參與逆膽固醇轉(zhuǎn)運,其cDNA堿基的改變有可能導(dǎo)致編碼氨基酸的改變,從而導(dǎo)致其功能改變。SNP系指人類基因組中大量存在的單個核苷酸的差異。核苷酸序列的一定差異決定了不同人種和不同個體的差異,以及不同人群疾病易感性和藥物治療敏感性的差異。因此,SNP是一個具有高度穩(wěn)定性的遺傳學(xué)標(biāo)記,可以成為尋找疾病相關(guān)基因,進行疾病診斷、預(yù)防和藥物篩選的基礎(chǔ)。目前至少報道了50個ABCA1的突變點,包括23個錯義突變,6個無義突變,21個插入或缺失突變。我們在以前的工作中曾首次發(fā)現(xiàn)了ABCA1基因介于內(nèi)含子12和內(nèi)含子14之間的1221bp和內(nèi)含子16和內(nèi)含子31之間的19.9kb的雙缺失突變和A935H錯義突變。資料顯示所有突變都導(dǎo)致脂質(zhì)流出的下降,在被檢測的突變中,磷脂和膽固醇流出的高度相關(guān)性說明ABCA1對兩種脂類的流出都有影響,說明ABCA1基因可能直接或間接介導(dǎo)磷脂和膽固醇的跨膜轉(zhuǎn)運。M233V型ABCA1基因改變在國內(nèi)外均未見相關(guān)報道,此位點cDNA位置為A1092G,由于堿基改變而導(dǎo)致氨基酸由甲硫氨酸(M)轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸(V)。此位點改變與R230C突變位點,R219KSNP位點均位于外顯子7,位于第一個細胞外大環(huán)內(nèi)(見圖3)。有研究顯示ABCA1兩個細胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)可能為ApoA1提供一個潛在的結(jié)合目標(biāo),受損的ABCA1結(jié)合子可能阻止?jié){膜與ApoA1之間的相互作用;此外,細胞外環(huán)氨基酸發(fā)生改變也有可能導(dǎo)致了ABCA1蛋白三級結(jié)構(gòu)的破裂,從而阻止了其與漿膜之間的相互作用。DNA測序結(jié)果和限制性酶切分析結(jié)果表明,我們檢測到的位點改變的基因型均為AG型。在我們所調(diào)查的家系里,AG型發(fā)生率為31.3%(5/16),說明M233VAG型SNP的發(fā)生具有家族傾向性,其家系中二人有心肌梗死病史(均為M233VAG型SNP),一人