豬A型塞內卡病毒分離鑒定范圍本文件規定了豬A型塞內卡病毒分離鑒定方法、RT-LAMP及RT-PCR診斷方法。本文件適用于豬A型塞內卡病毒的病原分離和鑒定、實驗室診斷、病毒檢測、流行病學調查。規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和實驗方法NY/T541-2016獸醫診斷樣本采集、保存與運輸技術規范縮略語下列縮略語適用于本文件。SVA：豬A型塞內卡病毒（曾用名：SVV）PBS：磷酸緩沖液DMEM：細胞營養液FBS：胎牛血清PK-15：豬腎細胞CPE：細胞病變DNAmarker：DNA相對分子質量標記HEPES：4-羥乙基哌嗪乙磺酸RT-LAMP：逆轉錄環介導等溫擴增試劑與設備試劑與耗材所用生化試劑均為分析純；實驗用水應符合GB/T6682一級水要求或采用超純水，并經高溫滅菌；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、DNA相對分子質量標記（100bp~2000bp）、2×PCR混合液、1%的X脂糖凝膠、MgSO4、無水乙醇、BstDNA聚合酶、核酸染料、dNTPs、LAMPbuffer等；無菌移液器吸頭、無菌眼科剪、一次性注射器、眼科鑷、無菌離心管；PK-15細胞、DMEM培養基、胰蛋白酶、HEPES緩沖液（1mol/L儲存液）、25cm2細胞培養瓶、0.22μm的一次性濾頭、0.01mol/LpH7.0~7.4PBS（參見附錄A）；4.1.6陽性對照：SVA（SVV-SC-01株）；陰性對照：PK-15細胞培養上清液；主要儀器設備微量移液器、組織破碎儀、組織研磨器、恒溫水浴槽或恒溫金屬浴、離心機、二氧化碳恒溫箱、通用型電泳儀、凝膠成像系統、熒光倒置顯微鏡、冰箱（2℃~8℃、-20℃、-70℃）。樣品的采集、保存與運輸樣品采集水泡液采集用一次性注射器吸取臨床發病豬只水泡液0.5~1ml，并將水泡液裝入保存管，加青霉素1000IU/mL、鏈霉素500IU/mL，加蓋封口，-70℃冷凍保存。水泡皮采集用0.01mol/LPBS（pH7.4）清洗水泡表面，然后用滅菌手術剪刀剪取水泡皮，2~5g為宜。采集到的水泡皮，裝入樣品保存管，加50%甘油-PBS保存液，使保存液液面沒過樣品，加蓋封口，-70℃冷凍保存。組織樣品采集若采集不到典型的水泡皮，則采集病灶周圍破潰組織或淋巴結、肺臟、扁桃體、腸道等組織5~10g，裝入樣品保存管，加50%甘油-PBS保存液，使保存液液面沒過樣品，加蓋封口，-70℃冷凍保存。保存與運輸采集的樣品應按照《獸醫診斷樣本采集、保存與運輸技術規范》（NY/T541-2016）要求包裝和運輸。病毒的細胞分離培養樣品的處理組織樣品處理取0.5g待檢組織樣品，加入1ml的PBS緩沖液置組織均漿器中充分研磨（或采用傳統液氮法研磨樣本），反復凍融3次后，用含青、鏈霉素的DMEM作3∶1（V/W）稀釋，3000r/min離心10min，取上清液，-70℃保存備用。或將充分研磨、反復凍融3次后的樣本加PBS緩沖液作3：1（V/W）稀釋后以0.22μm無菌濾膜過濾除菌后，-70℃保存備用。水泡液樣品處理水泡液4℃3000r/min離心10min，以0.22μm無菌濾膜過濾除菌后，-70℃保存備用。單層細胞制備在生物安全柜中操作，按常規方法將PK-15細胞或其他敏感細胞分裝在25cm2細胞培養瓶中，每瓶加入含8%FBS的DMEM培養基5mL，細胞濃度應為2~3×105個/mL，37℃、5%CO2條件下培養48h。樣品接種在生物安全柜中操作，取6.1中已處理好的上清液0.2ml接種到生長狀況良好的單層PK-15細胞上（5ml工作體積）。每份樣品接種2~4瓶細胞，另設細胞對照2~4瓶。37°C吸附1h，棄上清，加入5ml含2%FBS的DMEM培養基，37℃、5%CO2條件下培養48h。病毒收獲每天觀察記錄CPE，若被檢樣品中有A型塞內卡病毒，通常在接種48h后可出現CPE，主要呈現細胞變圓，空泡增加，有死細胞漂浮在液面，最后溶解脫落。對照細胞單層應完好，細胞形態基本正常或稍有衰老。若出現CPE，將接毒細胞反復凍融三次，4℃3000r/min離心10min，收獲病毒上清液，置-70℃保存，進行病毒核酸鑒定。若接種細胞第1代72h后未出現明顯CPE，按上述收毒方法收獲細胞/病毒液再接種生長良好的單層細胞進行盲傳，即1mL第一代細胞/病毒液加4mL細胞維持液，37℃培養。如此盲傳3~5代，再進行鑒定。病毒核酸鑒定對6.4中收集到細胞/病毒液，或經6.1處理后的臨床樣品，選用RT-LAMP方法（逆轉錄環介導等溫擴增法）和RT-PCR方法進行核酸鑒定。RT-PCR和RT-LAMP引物根據GenBank上已發表的SVA核酸序列（登錄號：KY618836），選擇編碼VP1蛋白的序列作為RT-LAMP和RT-PCR的靶序列，運用PrimerExplorerV4軟件設計一組RT-LAMP引物，包括外引物F3、B3，內引物FIP、BIP，使用Primer5軟件設計引物（F/R）進行RT-PCR擴增，相關引物序列見表1。表1引物序列檢測方法引物序列5′→3′位置bpRT-LAMPSVVF3CCGATCTCGACTACTGAATG2866～2886SVVB3GAGAACGCCACTGTCAGAC3017～3036SVVFIPCATCGTCCTGCTGTGCACCT-AGAAGGACGCCGTCTTCC2881～2941SVVBIPTTCTAACACCCCGCCCAACA-TTGACGTACAGGCCGAAAC2953～3013RT-PCRSVVFTACAGTTTGGCCTGTTTCACT3063～3083SVVRCGCCCAGTAAAGTGGTAGGG3210～3229RNA的提取選擇市售商品化RNA提取試劑盒，按照試劑盒操作說明書提取樣品中的RNA。在提取RNA時，應設立陽性和陰性對照樣品，按同樣的方法提取RNA。RNA提取操作應在通風柜或生物安全柜中進行，避免RNA氣溶膠的污染。反轉錄（cDNA的合成）配制反轉錄反應體系，使用商品化反轉錄試劑盒將7.2中提取的RNA反轉錄成cDNA，具體操作、體系參照說明書進行，cDNA于-20℃保存備用。RT-LAMP反應RT-LAMP反應體系反應體系中各組分見表2。表2RT-LAMP反應體系反應試劑總體系25μLBstDNA聚合酶緩沖液2.5μLRNA酶抑制劑（40U/μl）0.5μL反轉錄酶（200U/μl）0.75μLBstDNA聚合酶1μL甜菜堿（1mmol/l）2μLMgSO4（8mmol/l）2μL引物F3/B3（0.2μmol/l）各2μL引物FIP/BIP（1.6μmol/l）各4μLdNTPs（1.4mmol/L）2μLRNA模板（7.2中提取）1μLddH2O1.25μL其中BstDNA聚合酶緩沖液各組分為20mMTris-HCl（pH8.8），10mMKCl，10mM（NH4）2SO4，0.1%TritonX-100。RT-LAMP反應程序將7.4.1配制的反應體系置于65℃水浴或金屬浴反應45min后，再置于80℃反應10min，產物4℃保存。RT-PCR反應RT-PCR反應體系反應體系見表3。表3RT-PCR反應體系PCR反應試劑總體積10μLμL2×TaqPCRmasterMix5上游引物：F（10μmol/L）0.5下游引物：R（10μmol/L）0.5cDNA模板（7.3中產物）1ddH2O（無菌水）3RT-PCR反應程序反應程序見表4。表4RT-PCR反應程序步驟時間和溫度min、s/℃循環數個預變性5min/95℃1變性30s/95℃35退火30s/56℃延伸30s/72℃延伸7min/72℃1試驗結果觀察RT-LAMP顯色反應在每個RT-LAMP反應管內加入熒光染料SYBRGreenI0.5μL，渦旋混勻，在紫外光下觀察。X脂糖凝膠電泳成像PCR擴增結束后，取適量擴增產物加到1%的X脂糖凝膠加樣孔中，并加入陽性、陰性對照和DNAmarker。使用電泳儀進行電泳，電壓大小根據電泳槽長度確定，一般控制在4V/cm~6V/cm，電泳時間為10~20min。電泳結束后，將凝膠放在凝膠成像儀中觀察記錄成像結果。結果判定將RT-LAMP方法作為臨床快速檢測手段，最終分離鑒XX果需結合病毒分離和RT-PCR擴增測序結果進行綜合判定。RT-LAMP成立條件對照成立，即電泳結果陰性對照無條帶，陽性對照為1條梯狀條帶，且顯色反應陰性對照管無變化，陽性對照管發出綠色熒光。陰性判定電泳結果未出現與陽性對照一致條帶，顯色反應樣品管無綠色熒光變化，判定為：SVA核酸陰性。陽性判定電泳結果出現與陽性對照一致條帶，且顯色反應樣品管發出綠色熒光，判定為：SVA核酸陽性。RT-PCR成立條件對照成立，即電泳結果陰性對照無條帶，陽性對照出現1條167bp的DNA目的條帶。陰性判定電泳結果未出現與陽性對照大小一致DNA條帶，判定為：SVA核酸陰性。陽性判定電泳結果出現與陽性對照大小一致的DNA條帶，判定為：SVA核酸陽性。對陽性擴增條帶進行測序，并將測序結果與附錄B.3序列比對，作為分離鑒定最終判定條件。病毒分離鑒定若細胞發生CPE，同時8.1或8.2結果為陽性，且測序比對結果正確，則判定為：SVA分離鑒定陽性若盲傳3代后，細胞并未發生CPE，但8.1或8.2結果為陽性，則繼續盲傳至5代后，再進行RT-LAMP或RT-PCR核酸鑒定，若8.1或8.2結果仍為陽性，且測序比對結果正確，則判定為：SVA分離鑒定陽性，若8.1或8.2結果變為陰性，則判定為：SVA分離鑒定陰性。若盲傳3代后，細胞并未發生CPE，且8.1或8.2結果為陰性，則判定為：SVA分離鑒定陰性。

（規范性附錄）

試劑配制0.01mol/LpH7.0~7.4PBSNaCl8gKCl0.2gNa2HPO4?12H2O3.58gKH2PO40.27g滅菌雙蒸水800mLNaOH或者HCl調pH值7.0~7.4，滅菌雙蒸水定容至1000mL，121℃、15min高壓鍋滅菌冷卻，置常溫或4℃備用。電泳緩沖液TAE（50倍）三羥甲基甲烷堿（Trisbase）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四乙酸（EDTA）100mL蒸餾水100mL待上述混合物完全溶解后，加蒸餾水至1000mL，置4℃冰箱中備用，如配制1%的X脂糖凝膠和用作電泳緩沖液，則用蒸餾水稀釋50倍，成TAE電泳緩沖液。1.0%X脂糖凝膠板制備X脂糖1.0g1×TAE緩沖液100mL0.5ug/mLGoldView5uL微波爐充分溶解后，加入溴化乙錠，倒入凝膠板中，在距離底板0.5mm的位置上放置梳子，凝膠的厚度為4mm，待凝膠完全凝固后，小心移去梳子，將凝膠板放入電泳槽中，電泳緩沖液沒過膠面。

（資料性附錄）

豬A型塞內卡病毒簡介豬A型塞內卡病毒簡介A型塞內卡病毒（SenecavirusA，SVA）又稱為塞尼卡谷病毒（Senecavalleyvirus，SVV），是一類無囊膜單股正鏈RNA病毒，屬于小核糖核酸病毒科，塞內卡病毒屬，是該屬唯一成員。SVA基因組全長約7300nt，由一個6543nt的開放閱讀框，668nt的5’端非編碼區，68nt的3’端非編碼區以poly（A）尾組成。SVA病毒粒子為二十面體結構，呈小型近圓形，直徑約為17～25nm。SVA病毒基因組從頭到尾依次為長的5’端非編碼區，單一開放閱讀框（openreadingframe，ORF），短的3’端非編碼區。5’端非編碼區包含基因組相關蛋白（VPg）序列和IV型核糖體內部進入位點（IRES），VPg蛋白以共價鍵與5’端非編碼區連接，在病毒增殖過程中，可通過結合起始因子參與病毒RNA的翻譯。IRES能招募核糖體對病毒RNA進行翻譯，SVA的IRES在功能與結構上與經典豬瘟和乙型肝炎病毒的十分相似，這可能是由于持續感染的豬只中發生基因交換引起的。現已證實SVA感染豬能夠引發原發性水泡病，引起豬的鼻吻、蹄部冠狀帶的水泡病變，同時伴有跛行、厭食、嗜睡和發燒等臨床表現。與口蹄疫、豬水泡病和水泡性口炎引起的臨床癥狀難以區分。自2015年以來，在美國、中國、泰國等多個國家暴發了SVA疫情，造成了嚴重的經濟損失。SVA由于近些年才被發現，其臨床癥狀類似于口蹄疫，使得感染豬只的上市存在重大的風險。對于SVA這樣的豬場新病，全世界對其認知都比較有限，其對于豬場的短期和長期影響難以確切估計。SVA在巴西、美國和我國幾乎同時發生，說明其從被發現至今，或有進一步擴大和爆發的可能，而作為新出現的疾病，其潛在影響是不可估量的，不得不引起足夠的重視。且目前該病并無成熟的商業