青藤堿脂質體的制備工藝研究

青藤堿是預防感冒和類風濕性關節炎的常用藥物。由于其生物半衰期短,大鼠體內的t1/2僅為48.50min,因此代謝較快。目前市場上青藤堿的普通制劑,如片劑、注射劑等,需頻繁用藥才能達到治療效果,在臨床應用受到一定的限制。以脂質體為載體,將青藤堿制成關節局部應用的經皮給藥制劑,可減少藥物的全身吸收,使藥物集中于皮膚角質層,形成藥物貯庫,緩緩向關節部位釋藥,從而降低藥物的毒副作用,提高其生物利用度。而且脂質體本身的成分一般為體內所固有,無皮膚刺激等毒副作用。脂質體經皮給藥制劑已成為當前局部給藥制劑發展的一個趨勢。本研究采用適合于批量生產的注入法制備青藤堿脂質體,并采用混料均勻設計法優化青藤堿脂質體的膜材處方,在此基礎上進行制備工藝研究,為青藤堿經皮給藥制劑的研究開發提供實驗依據。1儀器、試劑與藥品SummitP680型高效液相色譜儀,PDA-100型二極管陣列檢測器,ASI-100型自動進樣器(德國Dionex公司);CQF-50型超聲波清洗器,中船七院七二六所;JEM-2010HR型高分辨透射電子顯微鏡,日本JEOL公司;青藤堿對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號0774-9904);青藤堿結晶(自制,制備工藝用);大豆卵磷脂(上海伯奧生物科技有限公司);膽固醇(上海源聚生物科技有限公司);維生素E(廣州萬利隆化工有限公司)。均勻設計軟件:UD3.0版(中國數學會均勻設計分會)。2方法和結果2.1脂質體包封率的測定處方以青藤堿、豆磷脂、膽固醇、維生素E(抗氧化劑)組成。以四者在其變量范圍內的百分含量作自變量,分別設為XA,XB,XC,XD,所得脂質體的包封率為因變量,進行處方優化。經預試驗確定4個自變量組成范圍,同時考慮歸一化條件,給出均勻設計的約束限制條件:在該限制條件下進行4因素的混料均勻設計,采用U9(94)表,由UD3.0均勻設計軟件安排試驗,因素水平見表1。2.1.2堿、豆酸鈉緩沖液、膽固醇、維生素e采用注入法制備脂質體。按表1中的處方比例(總量設定為1000mg),稱取青藤堿、豆磷脂、膽固醇、維生素E,加乙醚50mL使溶解;另取pH7.4磷酸鹽緩沖液50mL,置燒杯中,加熱至50℃并保持恒溫,在不斷攪拌下勻速注入乙醚溶液,加完后繼續攪拌1h至乙醚揮盡。超聲處理10min,即得乳白色脂質體混懸液。2.1.3青藤堿包封率測定按照前期建立的方法測定包封率。精密量取青藤堿脂質體混懸液0.5mL,加于SephadexG-50凝膠柱頂部,以pH7.4磷酸鹽緩沖液洗脫,流速1mL·min-1,收集4~11mL洗脫液,用氮氣吹至體積約0.5mL,加無水乙醇定容至10mL,搖勻。精密量取10μL溶液,進樣,測定峰面積,用外標一點法計算青藤堿的含量,計為Mlip;另精密吸取青藤堿脂質體混懸液0.5mL,用無水乙醇定容至10mL,搖勻。精密吸取10μL溶液,同法測定,計為Mtot,按下式計算包封率。各處方下包封率測定結果見表1,HPLC見圖1。包封率計算公式:包封率(EN%)=(Mlip/Mtot)×100%Mlip為脂質體中包封的青藤堿量;Mtot為脂質體混懸液中所含青藤堿總量。2.1.4回歸方程結果由于XA+XB+XC+XD=100%,如限定其中3個因素的水平,則另一因素的水平即可確定。本實驗選擇XA,XB,XC含量為回歸自變量,對因變量包封率作配方回歸,分別用一階和二階規范多項式建立回歸方程,求出最優回歸子集,并求其最優解。規范多項式計算公式如下:一階回歸結果:方程Y=73.41-67.94XA–4.70XC,R=0.4907,s=7.3088。方差分析結果見表2。查F臨界值表,得F0.05(2,6),F=0.9513,回歸方程無顯著意義。二階回歸結果:方程Y=147.83-1171.71XA+1150.17XAXB+1455.91XAXC-119.57XBXC-285.93XCXC,R=0.9909,s=1.5972。方差分析結果見表3。查F臨界值表,得F0.05(5,3)=9.01,F=32.4951,回歸方程有顯著意義。由回歸處理結果可見,二階回歸復相關系數接近于1,殘差標準差相對較小,結果有顯著意義。因此,選用二階方程進行模型分析,求出最大解,得出最優處方配比為:XA=8.92%,XB=60.35%,XC=28.81%,XD=1.91%。將以上結果代入回歸方程,求得在此配比條件下的預測包封率Y=75.36%。2.2維生素a、g、維生素e制備按脂質體膜材的優選處方配比,稱取青藤堿89mg,豆磷脂604mg,膽固醇288mg,維生素E19mg,加乙醚50mL使溶解,共制備4份;另分別取磷酸鹽緩沖液25,50,75,100mL,置燒杯中,加熱至50℃并保持恒溫,在不斷攪拌下勻速注入乙2.3包封率的測定按上述優選處方稱取青藤堿、豆磷脂、膽固醇、維生素E,加乙醚50mL使溶解,共制備4份;另取磷酸鹽緩沖液50mL4份,置燒杯中,分別加熱至40,50,60,70℃并保持恒溫,在不斷攪拌下勻速注入乙醚溶液,加完后繼續攪拌1h至乙醚揮盡,超聲處理10min,得脂質體混懸液。分別測定包封率,結果見表5。可見制備溫度為50℃時,所得脂質體的包封率最高。2.4超聲處理包封率的測定按上述優選處方稱取青藤堿、豆磷脂、膽固醇、維生素E,共取5份,分別加乙醚50mL使溶解;另取磷酸鹽緩沖液50mL,置燒杯中,加熱至50℃并保持恒溫,在不斷攪拌下勻速注入乙醚溶液,加完后繼續攪拌1h至乙醚揮盡,分別超聲處理5,10,20,30,40min,得脂質體混懸液。分別測定包封率,結果見表6。可見超聲時間從5~20min間包封率逐漸遞增,而20min后包封率逐漸遞減,因此超聲時間確定為20min。2.5透射電子顯微鏡psm觀察將青藤堿脂質體置透射電鏡下觀察。采用磷鎢染法制樣,取1滴脂質體乳液滴于點滴反應瓷板的凹槽內,將噴碳銅網置于試液上(膜面向下),1~2min后取出銅網,用濾紙從銅網邊緣吸干多余液體;按上述同樣方法,將該銅網放在染液滴上(4%磷鎢酸溶液,pH6.5)約30s,用濾紙從銅網邊緣吸干多余染液,自然揮干,用透射電子顯微鏡觀察并拍攝照片,見圖2。從照片可以看出,不同粒徑的脂質體形態完整,雙分子膜結構清晰,均屬于單室脂質體,經激光粒度分析儀測定,平均粒徑約200nm。3脂質體配方均勻設計試驗本研究前期已對青藤堿脂質體的制備方法進行了篩選,比較了薄膜分散法、逆相蒸發法及乙醚注入法的包封率,結果確定采用乙醚注入法進行制備。本研究進一步采用有約束混料設計法優選注入法制備脂質體的配方,并采用單因素考察法優選了注入法工藝的制備條件,按優化后工藝制備的脂質體包封率可達76.21%。在實驗中發現,外水相的用量也影響脂質體的包封率,隨著磷酸鹽緩沖液用量的增大,包封率呈下降趨勢。可能由于脂質體在外水相比例擴大后,溶液得到稀釋,脂質體內被包封的藥物易從內向外滲漏。究采用的混料均勻設計作為一種處方優化試驗方法,亦稱為配方均勻設計,是均勻設計中的重要組成部分。試驗中,每個因素的貢獻被表示為其在處方中所占配比,所有因素總和為100%。在此條件下對各因素變量進行邊界約束,并進行均勻設計,通過試驗求出最優解,從而計算和推測最佳混料比。與傳統的均勻設計相比,混料均勻設計只需給出期望的實驗次數以及各因素的水平范圍,不必給出具體水平,所以各試驗點的設置更具代表性和合理性,試驗次數更少,優化結果更加穩定和準確;此外,在制劑處方配比設計中,傳統的均勻設計優化所確定的組分總用量不恒定,導致制劑的總量也隨之波動,從而造成總體積或重量的不確定性;而有約束混料均勻設計可將處方組分總量設定為100%,