脂肪干細胞對不同來源成纖維細胞功能的影響

皮膚衰老是身體衰老的重要組成部分。它不僅傷害了你的臉，還與許多疾病的發生密切相關。因此,預防和延緩衰老已成為生命科學研究的熱點之一。脂肪干細胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)目前被認為是具有極大應用價值的成體干細胞來源。ADSCs取材方便,并且存活率高,在低血糖、低谷氨酰胺、低氧濃度下仍可保持活性。有文獻報道,ADSCs培養液能刺激傷創傷創面的成纖維細胞的增殖以及促進創面的愈合,這為研究ADSCs對正常人真皮成纖維細胞的作用提供了依據。本實驗通過Transwell,小室模擬人體皮下ADSCs和真皮成纖維細胞所處的內環境狀態,觀察ADSCs對不同年齡來源成纖維細胞的影響。1材料和方法1.1材料表面1.1.1皮膚、肌肉組織脂肪標本來自重慶醫科大學附屬第一醫院整形美容科吸脂術后脂肪組織(供者為20歲健康女性,脂肪標本取之其腹部脂肪組織),約20ml;青年人(平均年齡<25歲)和老年人(平均年齡>60歲)皮膚標本來自重慶醫科大學附屬第一醫院整形美容科局麻手術后切下健康的、丟棄的皮膚組織(所有標本均征得患者同意并簽署知情同意書)。標本的收集以及實驗均征得重慶醫科大學附屬第一醫院倫理委員會的同意。1.1.2細胞劑和mtt試劑DMEM(F12)培養基購自Gibco公司,胎牛血清購自HyClone公司,Transwell小室購自Corning公司,膠原酶和胰蛋白酶購自Sigma公司,CD90鼠抗人一抗購自BD公司,CD34、CD44鼠抗人一抗購自Millipore公司,異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)標記的流式細胞檢測羊抗鼠二抗來自四正柏公司,MTT試劑盒購自凱基公司,ReverTreAce-a-逆轉錄試劑盒購自TOYOBO公司。1.1.3材料、儀器和儀器無菌操作臺(中國蘇凈集團),高速離心機(Sigma公司),超低溫冰箱(美國NBS),恒溫水浴箱(中國江蘇金壇榮華),細胞培養箱(美國賽默飛公司),倒置顯微鏡(OLYMPUS公司),PCR儀(Bio-Rad公司),酶標儀,(BioTek公司),流式細胞儀(美國BD公司)。1.2方法1.2.1細胞傳代培養將脂肪組織懸液分裝于離心管內,離心5min,棄下層液體,再用含雙抗的PBS反復沖洗組織3次,加入0.1%Ⅰ型膠原酶,于37℃水浴鍋內振蕩消化30min;離心后去上清,加入含10%血清的DMEM(F12)培養基終止消化后,用孔徑75μm的細胞篩過濾,再次離心去上清,用含10%血清的DMEM(F12)培養基重懸接種于培養瓶中,置于37℃、5%的CO2培養箱中常規培養,2d后首次換液,細胞長滿90%融合后進行傳代。取3代生長良好的ADSCs進行流式細胞表面抗原鑒定。1.2.2皮膚組織的孵化將皮膚組織用含雙抗的PBS反復沖洗3次,用眼科剪剪去皮下結締組織,將皮膚組織放入含0.25%胰酶10ml無血清的DMEM(F12)培養基中,37℃、5%的CO2培養箱中孵育30min。用眼科剪將孵育后的皮膚組織盡量剪碎,再將皮膚組織放入含0.25%胰酶10ml無血清的DMEM(F12)培養基中,37℃、5%的CO2培養箱中孵育3h。用75μm的細胞篩過濾,離心去上清,用含10%血清的DMEM(F12)培養基重懸接種于培養瓶中,置于37℃、5%的CO2培養箱中常規培養,2d后首次換液,細胞長滿90%融合后進行傳代。1.2.3成纖維細胞+abss評分實驗分為4組:A組,老年人成纖細胞組;B組,老年人成纖維細胞+ADSCs共培養組;C組,青年人成纖維細胞組;D組,青年人成纖維細胞+ADSCs共培養組。每組設3個副孔,A組和C組分別為老年人對照組和青年人對照組,B組和D組分別老年人實驗組和青年人實驗組。各組共培養時間均為3d。1.2.4皮膚成纖維細胞的制備利用微孔直徑為0.4μmTranswell小室建立非接觸的細胞共培養系統。選取3代生長狀態良好的青年人和老年人皮膚成纖維細胞,用胰酶消化制成單細胞懸液,密度均為2×105/ml,接種于12孔板,青年和老年皮膚成纖維細胞各6孔,每孔1ml。再取3代生長狀態良好的ADSCs,用胰酶消化制成單細胞懸液,密度為1×105/ml,接種于Transwell內底面,將小室置于接種有成纖維細胞的孔板中。A組和C組不置入Transwell小室。1.2.5細胞形態觀察1.2.6酶標法確定各孔吸收劑用量移去共培養小室,每孔加入MTT反應液500μl,在細胞培養箱中孵育4h,吸出液體后每孔加入二甲基亞砜溶液1ml,振蕩溶解10min,將液體移入96孔板,每孔重復3次,在酶標儀上選擇490nm波長,檢測各孔吸光度(absorbance,A)值。1.2.7rt-pcr檢測半乳糖苷酶基因表達由南京金斯瑞公司科技有限公司設計并合成引物。Ⅰ型膠原上游引物序列為5’-GCACGAAACACACT-GGGAATG-3,下游引物序列為5’-GGCCAACGTCCACAC-CAAATTC-3’,產物長度為262bp;MMP-1上游引物序列為5’-CCCCAAAAGCGTGTGACAGTAAG-3’,下游引物序列為5’-GAAGGGATTTGTGCGCATGTAGA-3’,產物長度為200bp;β-半乳糖苷酶上游引物序列為5’-GTGCATTGGCCAT-ACCCTTAGG-3’,下游引物序列為5’-CACACGGTCAGCA-TGCATAAATA-3’,產物長度為259bp。內參照β-actin上游序列5’-ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3’,下游序列5’-TC-CCGGCCAGCCAGGTCCA-3’,產物長度249bp。提取各組成纖維細胞RNA,紫外分光光度計測定260/280nm波長下A值,計算RNA濃度,按試劑盒說明進行反轉錄操作。上熒光定量PCR儀,擴增條件為:94℃,5min;94℃30s,57℃30s,72℃30s,共45個循環;72℃,10min。1.3統計學處理所有數據采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析,數據均為計量資料,用均數±標準差(ue0af±s)表示,數據采用單因素方差分析,總體差異有統計學意義情況下,兩組之間比較再采用LSD-t法進行組間較。檢驗水準α=0.05。2結果2.1青年—共培養后成纖維細胞形態觀察老年人成纖維細胞體積較大,形狀不規則,多呈多突起的扁平星狀,細胞質中有較多的顆粒狀物質沉積(圖1)。共培養后的老年人成纖維細胞,逐漸轉變為長梭型,細胞質中顆粒狀物質消失(圖2)。青年人成纖維細胞形狀規則,多呈長梭型(圖3)。共培養后的青年人成纖維細胞形狀無明顯改變,但細胞整體分布呈旋渦狀(圖4)。2.2細胞表面反應流式結果顯示所選取的第3代ADSCs細胞表面抗原CD34、CD44、CD90分別表達為6.28%、95.72%、98.92%,分別見圖5~7。2.3兩組患者a值的比較應用MTT法檢測共培養3d后各組成纖維細胞的增殖情況,結果顯示:老年人對照組,老年人實驗組,青年人對照組和青年人實驗組的A值分別為0.183±0.037、0.414±0.051、0.303±0.048和0.784±0.011(F=423.838,P=0.000),其中老年人實驗組A值高于老年人對照組A值(t=12.956,P=0.000);青年人實驗組A值高于青年人對照組A值(t=26.955,P=0.000);青年人實驗組A值高于老年人實驗組A值(t=20.735,P=0.000),差異均有統計學意義,見圖8。2.4ct值的比較用RT-PCR檢測共培養3d后各組成纖維細胞的Ⅰ型膠原,MMP-1,β-半乳糖苷酶mRNA表達結果,其中在Ⅰ型膠原和β-半乳糖苷酶mRNA的表達中:老年人實驗組的CT值高于老年人對照組的CT值(P=0.000),青年人實驗組的CT值高于青年人對照組的CT值(P=0.000),其中Ⅰ型膠原青年人實驗組的CT值高于老年人實驗組的CT值(P=0.002),β-半乳糖苷酶青年人實驗組的CT值高于老年人實驗組的CT值(P=0.000),差異均有統計學意義。而在MMP-1mRNA的表達中:老年人對照組的CT值高于老年人實驗組原的CT值(P=0.000),青年人對照組的CT值高于青年人實驗組的CT值(P=0.000),差異有統計學意義;老年人實驗組的CT值高于青年人實驗組的CT值(P=0.055),差異無統計學意義,此此結果的產生可能與共培養后青年人成纖維細胞和老年人成纖維細胞增殖均較活躍,產生的MMP-1均較少有關,見表1。3與相關成纖維細胞的共培養及應用穩定性研究人體衰老主要表現為隨時間的推移包括皮膚組織形態的退行性改變以及皮膚生理功能的減退,最明顯的特征就是組織量的減少和成分的改變。皮膚組織量的減少同時包括成纖維細胞、肥大細胞、巨噬細胞在內的細胞數量的減少和細胞外基質的減少;而細胞外基質的減少的原因除了皮膚內細胞數量外,還包括合成功能的減退以及基質降解酶的增加以及膠原凈含量降低。有文獻報道,在動物研究中發現ADSCs以及其培養液能刺激傷口中的成纖維細胞的移行和膠原合成。另有文獻報道,ADSCs能分泌多種細胞因子,如:VEGF,TGF-β,IGF等。有人研究發現,研究者從自愿者自體脂肪組織中提取ADSCs后注射到志愿者光老化的皮膚中,發現局部皺紋得到改善。本實驗通過Transwell來模擬人體皮下ADSCs和真皮成纖維細胞所處的內環境狀態。Transwell膜為聚碳脂膜,膜上有孔,孔徑為0.4μm,能讓生物大分子自由通過膜的微孔,而不能讓細胞通過微孔,這樣上下小室的細胞便不能直接接觸。實驗中將ADSCs種于上室,成纖維細胞種于下室,上下兩室的培養液都能通過聚碳脂膜相互交換,從而觀察在非接觸狀態下ADSCs對成纖維細胞的影響。另外,本實驗不僅選用老年人成纖維細胞之間進行實驗對照,而且還選擇青年人成纖維細胞和老年人成纖維細胞進行實驗對照,這就能更直觀的反映ADSCs作用于成纖維細胞后,成纖維細胞增殖及膠原蛋白分泌增加的程度。比較圖1~4可以看出,通過與ADSCs共培養,老年人成纖維細胞的形態由不規則的突起的扁平星形逐漸轉變為梭形,細胞質內顆粒物質逐漸消失,細胞增殖能力明顯增強。細胞衰老的形態學特征表現為:細胞體積增大,細胞質內色素沉積,細胞器碎裂,細胞核增大顏色加深等,但通過與ADSCs培養后,老年人成纖維細胞的形態逐漸向青年人成纖維細胞形態轉變,這說明ADSCs能在一定程度上促進老年人成纖維細胞年輕化。本實驗研究結果顯示,Ⅰ型膠原在老年人實驗組和青年人實驗組的成纖維細胞中mRNA表達明顯增高,且青年人實驗組高于老年人實驗組。Ⅰ型膠原主要分布在人體在皮膚組織,隨著年齡增長,在成纖維細胞含量逐漸下降。這說明了通過與ADSCs共培養,老年人和青年人成纖維細胞合成膠原蛋白的能力增強。MMP-1在老年人實驗組和青年人實驗組成纖維細胞中的mRNA表達明顯降低,且老年人實驗組高于青年人實驗組。MMP-1是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原主要降解的關鍵酶,在正常增殖旺盛的成纖維細胞中表達量很低,這表明了通過與ADSCs共培養,老年人和青年人成纖維細胞不僅增殖能增強,而且膠原蛋白分泌也得到積累。β-半乳糖苷酶在老年人實驗組和青年人實驗組的成纖維細胞中mRNA表達明顯增加,且青年人實驗組高于老年人實驗組。β-半乳糖苷酶是1995年發現的細胞衰老的一個特征,隨著年齡增長,人體成纖維細胞中的β-半乳糖苷酶會逐漸積累。ADSCs在促進成纖維細胞增殖的同時,可能也