蘭州交通大學化學與生物工程學院綜合能力訓練Ⅰ——文獻綜述題目：基因敲除技術研究進展作者：王振宇學號：201207744指導教師：謝放完成日期：2014-7-16基因敲除技術研究進展摘要基因敲除是自20世紀80年代末以來發展起來的一種新型分子生物學技術，是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術。在總結已有研究成果的基礎上，本文對基因敲除技術的概況、原理方法應用以及近年來基因敲除技術的研究進展作一個簡單的綜述。關鍵詞基因敲除RNAi生物模型基因置換基因打靶同源重組1.基因敲除技術簡介

基因敲除(Geneknockout)是指一種遺傳工程技術，針對某個序列已知但功能未知的序列，改變生物的遺傳基因，令特定的基因功能喪失作用，從而使部分功能被屏障，并可進一步對生物體造成影響，進而推測出該基因的生物學功能。它克服了隨機整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質的方法?；蚯贸柚肿由飳W、細胞生物學和動物胚胎學的方法,通過胚胎干細胞這一特殊的中間環節將小鼠的正常功能基因的編碼區破壞,使特定基因失活,以研究該基因的功能；或者通過外源基因來替換宿主基因組中相應部分,以便測定它們是否具有相同的功能，或將正常基因引入宿主基因組中置換突變基因以達到靶向基因治療的目的?；蚯贸墙沂净蚬δ茏钪苯拥氖侄沃?。通常意義上的基因敲除主要是應用DNA同源重組原理，用設計的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),從而達到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術的發展,除了基因打靶技術外,近年來新的原理和技術也逐漸被應用,比較成功的有RNA干擾技術,同樣也可以達到基因敲除的目的。簡單的說基因敲除是指將目標基因從基因組中刪除?；蚯贸夹g主要應用于動物模型的建立，而最成熟的實驗動物是小鼠，對于大型哺乳動物的基因敲除模型還處于探索階段。這項技術的誕生可以說是分子生物學技術上繼轉基因技術后的又一革命。尤其是條件性、誘導性基因打靶系統的建立，使得對基因靶位時間和空間上的操作更加明確、效果更加精確、③.在2

個loxP

位點之間的重組率較高；

④.如用病毒或配體DNA

復合物等基因轉移系統來介導Cre的表達，則可省去建立攜帶Cre的轉基因動物的過程。2.2利用隨機插入突變進行基因敲除2.2.1基因捕獲法

基因捕獲法是最近發展起來的利用隨機插入突變進行基因敲除的新型方法。通?；虿东@載體還包括一個無啟動子的報道基因，通常是neo基因，neo基因插入到ES細胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉錄調控元件實現表達的ES克隆可以很容易地在含G418的選擇培養基中篩選出來，從理論上講，在選擇培養基中存活的克隆應該100％地含有中靶基因[9]。中靶基因的信息可以通過篩選標記基因側翼cDNA或染色體組序列分析來獲得2.2.2原理：此法利用某些能隨機插入基因序列的病毒，細菌或其他基因載體，在目標細胞基因組中進行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細胞庫，然后通過相應的標記進行篩選獲得相應的基因敲除細胞。根據細胞的不同，插入載體的選擇也有所不同。逆轉率病毒可用于動植物細胞的插入；對于植物細胞而言農桿菌介導的T-DNA轉化和轉座子比較常用；噬菌體可用于細菌基因敲除。2.2.3基因捕獲法的優缺點

用常規方法進行基因敲除研究需耗費大量的時間和人力，研究者必須針對靶位點在染色體組文庫中篩選相關的染色體組克隆，繪制相應的物理圖譜，構建特異性的基因敲除載體以及篩選中靶ES細胞等，通常一個基因剔除純合子小鼠的獲得需要一年或更長的時間。面對人類基因組計劃產生出來的巨大的功能未知的遺傳信息，傳統的基因敲除方法顯得有些力不從心[10]。因此，基因捕獲法應運而生，利用基因捕獲可以建立一個攜帶隨機插入突變的ES細胞庫，節省大量篩選染色體組文庫以及構建特異打靶載體的工作及費用，更有效和更迅速地進行小鼠染色體組的功能分析。

此方法的缺點是只能剔除在Es細胞中表達的基因。單種的細胞類型中表達的基因數目約為I04，現在的基因捕獲載體從理論上來講應能剔除所有在ES細胞表達的基因，因此，在ES細胞中進行基因捕獲還是大有可為的。用基因捕獲法進行基因剔除的另一個缺點是無法對基因進行精細的遺傳修飾。2.3RNAi引起的基因敲除。2.3.1基因敲除技術與RNA干擾技術（RNAi）

RNAi是近兩年才發展起來的一種在RNA水平上研究及印尼功能的技術。將化學合成的雙鏈RNA分子（dsRAN）或將能表達dsRNA的載體轉導入體外或動物體的細胞內,dsRNA會介導受體細胞中序列特異的同源靶mRNA發生降解或受阻，引發受體細胞產生轉錄后水平的基因沉默，使之與相應的內源靶基因表達被阻抑，從而獲得類似于基因敲除的基因阻抑效果[12]。RNA干擾為基因和蛋白質學的研究等提供了嶄新的技術方法，大有取代基因敲除技術的趨勢，但是RNA干擾技術存在許多問題，使它不能完全替代基因敲除技術：一、RNAi不適用于所有的細胞，而基因敲除技術則可以作用于個體胚胎發育各個介段，能精確地敲除任何組織或器官的目的基因；二、RNAi在低等生物中能高效誘發基因沉默，但是在哺乳動物中，RNAi的抑制效果遠遠不如在低等生物體中那么明顯，而基因敲除對哺乳動物的效果也是明顯的；三、基因敲除得到的動物模型具有遺傳性，能夠進行繁殖而獲得大量的基因敲除動物群體，有利于實驗的延續，而RNAi的基因沉默是沒有遺傳性的。由于少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達，并且這種效應可以傳遞到子代細胞中,所以RNAi的反應過程也可以用于基因敲除。近年來，越來越多的基因敲除采用了RNAi這種更為簡單方便的方法[13]。2.3.2RNAi阻斷基因表達的機理

雙鏈RNA進入細胞后，能夠在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，而另一方面雙鏈RNA還能在RdRP（以RNA為模板指導RNA合成的聚合酶RNA-directed

RNA

polym的雙鏈解開變成單鏈，并和某些蛋白形成復合物，Argonaute2是目前唯一已知的參與復合物形成的蛋白。此復合物同與siRNA互補的mRNA結合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補鏈。結果mRNA也變成了雙鏈RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。這些新生成的siRNA也具有誘發RNAi的作用，通過這個erase，RdRP）的作用下自身擴增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA聚合酶鏈式反應，細胞內的siRNA大大增加，顯著增加了對基因表達的抑制。從21到23個核苷酸的siRNA到幾百個核苷酸的雙鏈RNA都能誘發RNAi，但長的雙鏈RNA阻斷基因表達的效果明顯強于短的雙鏈RNA[14]。2.3.3RNAi基因敲除①.比用同源重組法更加簡便，周期大大縮短。②.對于哺乳動物，如對于一些敲除后小鼠在胚胎時就會死亡的基因，可以在體外培養的細胞中利用RNAi技術研究它的功能。

③.由于RNAi能高效特異的阻斷基因的表達，它成為研究信號傳導通路的良好工具。

④.RNAi還被用來研究在發育過程中起作用的基因，如可用RNAi來阻斷某些基因的表達，來研究他們是否在胚胎干細胞的增殖和分化過程中其起著關鍵作用。2.4實現基因敲除的其他原理。

除上述幾種已經比較成熟并且普遍使用了的基因敲除原理外，還有一些基于其他原理的敲除技術正處于研究和完善過程中，如TFOs（Triple

helix

forming

oligonucleotides）引導的基因敲除術以及反義技術在基因敲除技術中的運用等[15]。隨著遺傳學，分子生物學理論的發展，新的基因敲除原理也在不斷的發現和發掘中。

3.基因敲除技術的前景基因敲除技術現在以廣泛的應用于各個領域并取得了快速的發展，應用此技術可以建立生物模型、培育新的生物品種、還可以用于疾病的分子機理研究和疾病的基因治療等?；蚬こ碳夹g是本世紀分子生物學史上的一個重大突破，而基因敲除技術則可能是遺傳工程中的另一重大飛躍。它為定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技術支持。

3.1建立生物模型。在基因功能，代謝途徑等研究中模型生物的建立非常重要?；蚯贸夹g就常常用于建立某種特定基因缺失的生物模型，從而進行相關的研究。這些模型可以是細胞，也可以是完整的動植物或微生物個體。最常見的是小鼠，家兔、豬、線蟲、酵母和擬南芥等的基因敲除模型也常見于報道[16]。3.2在培育新物種的研究。作為一項新興的微生物育種技術，基因敲除克服了傳統誘變方法的盲目性和偶然性，敲除后改變的基因會隨染色體DNA進行復制，改良的菌種可以穩定地用于后續的研究和生產。這樣的方法具有很強的目的性，大大節省了為生物技術研究的時間。3.3疾病的分子機理研究和疾病的基因治療[3-5]。通過基因敲除技術可以確定特定基因的性質以及研究它對機體的影響。這無論是對了解疾病的根源或者是尋找基因治療的靶目標都有重大的意義。3.4提供廉價的異種移植器官。眾所周知，器官來源稀少往往是人體器官移植的一大制約因素，而大量廉價的異種生物如豬等的器官卻不能用于人體。這是因為異源生物的基因會產生一些能引起人體強烈免疫排斥的異源分子，如果能將產生這些異源分子的基因敲除，那么動物的器官將能用于人體的疾病治療，這將為患者帶來具大的福音。如：PPL

Therapeutics

公司于1999

年已成功地在豬的體細胞中用基因敲除技術敲除了α－1，3GT

基因。使每只豬都缺乏產生a１－３半乳糖基轉移酶的基因的２個拷貝。這些酶在細胞表面產生一種糖分子，人體的免疫系統可以立即辨認出這種糖分子為異源性，從而引發超急性免疫排斥反應。在缺乏這種酶的情況下，超急性排斥反應即不會再發生。3.5免疫學中的應用。同異源器官移植相似，異源的抗體用于人體時或多或少會有一定的免疫排斥，使得人用抗體類藥物的生產和應用受阻[17]。而分子基因敲除，換以人的相應基因，那么將產生人的抗體，從而解決人源抗體的生產問題。

3.6基因敲除技術與RNA干擾技術（RNAi）

RNAi是近兩年才發展起來的一種在RNA水平上研究及印尼功能的技術。將化學合成的雙鏈RNA分子（dsRAN）或將能表達dsRNA的載體轉導入體外或動物體的細胞內,dsRNA會介導受體細胞中序列特異的同源靶mRNA發生降解或受阻，引發受體細胞產生轉錄后水平的基因沉默，使之與相應的內源靶基因表達被阻抑，從而獲得類似于基因敲除的基因阻抑效果。RNA干擾為基因和蛋白質學的研究等提供了嶄新的技術方法，大有取代基因敲除技術的趨勢。但是RNA干擾技術存在許多問題，使它不能完全替代基因敲除技術：一、RNAi不適用于所有的細胞，而基因敲除技術則可以作用于個體胚胎發育各個介段，能精確地敲除任何組織或器官的目的基因；二、RNAi在低等生物中能高效誘發基因沉默，但是在哺乳動物中，RNAi的抑制效果遠遠不如在低等生物體中那么明顯，而基因敲除對哺乳動物的效果也是明顯的；三、基因敲除得到的動物模型具有遺傳性，能夠進行繁殖而獲得大量的基因敲除動物群體，有利于實驗的延續，而RNAi的基因沉默是沒有遺傳性的。4．總結隨著基因敲除技術的發展，早期技術中的許多不足和缺陷都已經解決，但基因敲除技術始終存在著一個難以克服的缺點，即敲掉一個基因并不一定就能獲知該基因的功能，其原因包括[7]：一方面，許多基因在功能上是冗余的，敲掉一個在功能上冗余的基因，并不能造成容易識別的表型，因為基因家族的其他成員可以提供同樣的功能；另一方面，對于某些必需基因，敲除后會造成細胞的致死性也就無法對這些必需基因進行相應的研究了。同時，基因敲除研究中還存在的主要問題有：基因敲除的成功率很低，檢測發生同源重組干細胞的工作比較困難；重定向敲除基因的動物中篩選出具備理想基因型的動物依舊耗時長；基因敲除后的功能可能被其他基因的代償作用補償而不表現出表型缺陷。基因敲除技術的研究為生命科學帶來了不可估量的價值，也為人類的健康做出了巨大的貢獻，但是，基因敲除中仍然存在著一部分作用機理未完全研究清楚以及相應的應用問題有待研究，我們應該站在巨人的肩膀上，使基因敲除技術的研究與應用更上一層樓。參考文獻：

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