酵母生物學研究的幾個問題

1工業酵母的分類母細胞象是一種低水平的真核生物。它不僅具有類似原核生物的生長特性（易于栽培、快速繁殖、易于遺傳移動等），而且具有典型的真核生物特性。酵母作為人類利用最早的微生物,和人類的生活極其密切,是釀造、食品、飼料等領域應用最廣泛的工業微生物。酵母生物學研究的最顯著特點是基礎理論研究與應用實踐研究的內在統一,酵母不僅是研究真核細胞各種生命過程的有用模型和重要工具,而且也是外源真核生物基因表達的適宜宿主生物,對現有工業酵母菌種遺傳改良和重組基因工程酵母生產外源蛋白顯示出廣闊的前景。酵母并非為一個嚴格的分類學概念,它是一類單細胞世代較長的低等真核生物的統稱。至少包括80個屬,600個種,10000多個獨立菌株。常將其分成3大類:(1)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),又稱面包酵母,有真核生物中“大腸桿菌”的美名,主要以發酵糖類產生乙醇和CO2為主要特征。一般人們討論的酵母就是這一類酵母,它們是工業酵母應用中最重要的一類。(本文以下不特殊說明的酵母就指釀酒酵母)(2)粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe),人們對其研究遠遠不及釀酒酵母,其在分子及細胞生物學方面更加接近高等真核生物,以無性裂殖為特征,其單倍細胞僅有3條染色體。(3)非常規酵母(Nonconventionalyeast),除釀酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母統稱,近年這一類生物資源引起了人們的強烈興趣,它的一些菌種為條件性致病菌,如Candidaalbicans(白假絲酵母,即“白色念球菌”),引起人們興趣的主要原因是非常規酵母在生物工程方面的應用前景很廣闊,對Pichiapastoris(巴氏畢赤酵母,即甲醇酵母)、Kluveromyces(克魯維酵母)、Candida(假絲酵母)、Rarrowia和Hansenula等屬酵母的一些菌株已建成了基因表達系統,其中尤以Pichiapastoris和KluveromycesLactis較為重要。2遺傳多樣性研究釀酒酵母的工業應用比較廣泛,歷史悠久,遺傳背景清楚,不產生有毒物質,生物安全性好,易于推廣應用,現已成為分子生物學研究最重要的工具和模型。2.1雙鏈環形dna的制備酵母細胞核內有16條染色體,基因組為12052kb,核外線粒體mtDNA為長約25μm(約75kb)的雙鏈環狀分子,常見內源質粒為2μ雙鏈環狀DNA(6kb,周長約2μm),每個單倍體基因組含質粒60～100個拷貝。酵母基因組與高等真核生物基因組相比,最突出的特點是其緊密性(compactness),共有6138個ORFs,編碼蛋白質的基因預計共有5800個,約有6%～7%為不編碼蛋白質的基因。2.2菌株結構及染色體結構酵母細胞染色體在有絲分裂或減數分裂期間能高度有序地傳遞給子細胞,已知有3種結構成分對染色體有效、穩定遺傳是必需的:(1)ARS(autonomouslyreplicatingsequence自主復制序列),染色體自主復制序列,是從酵母中克隆的真核細胞DNA復制起點序列。酵母每條染色體由多個復制子組成,復制子平均長度為36kb,整個基因組約由400多個復制子組成。(2)CEN(centromeresequence著絲粒序列),著絲粒是真核細胞染色體在細胞分裂中精確分離的必需結構,每個染色體都具有一個著絲粒,現已分離了多個CEN序列,其大小為900～600bp,CEN不具有染色體專一性,卻具有種屬專一性。(3)TEL(telomericsequences端粒順序),線性染色體DNA保持復制穩定性所必須的端粒順序,為富含TG的長約3000～4000bp的序列,酵母和四膜蟲的TEL基本相似,可以通用。YAC(yeastartificialchromosome酵母人工染色體)將上述酵母染色體3種基本功能性成分及選擇標記基因有效組合構建了酵母人工染色體(Murray,Szostak1983),YAC實際應用中都以穿梭載體的形式構建,含有pBR322中的Ampr和Ori,酵母中常用的選擇基因為TRP1,URA3和SUP4,YAC中的TEL序列也可來自四膜蟲。YAC承載的外源基因片段為200～1000bp。2.3母類基因調控區的基本原理酵母基因組雖小,但其表達調控過程與其它真核生物相似,酵母作為真核基因表達載體,用于大量生產外源蛋白質,是真核生物基因表達研究的理想工具。(1)酵母的轉錄由3種RNA多聚酶催化,編碼RNA聚合酶的基因與其它真核生物3種RNA聚合酶基因同源性很高。對酵母反式作用因子(轉錄因子)GAL4、ADR1、PPRI等研究,發現絕大多數酵母轉錄因子的特征激活結構域能促進哺乳動物細胞的基因轉錄,然而若干哺乳動物轉錄因子的激活結構域并不促進酵母基因的轉錄。(2)酵母Ⅱ類基因調控區的基本結構特點:結構基因上游大約100bp處含一個或多個TATA盒作為核心啟動子,在位于Cap位點上游幾百bp處是上游激活序列(UAS),UAS結構和功能方面類似于哺乳動物中的增強子,轉錄總是在TATAbox下游80～120bp的特定位置開始。結構基因3′末端有效的終止子終止轉錄。(3)酵母mRNA具有典型的真核結構:5′-帽子,3′-polyA,成熟的mRNA以初級轉錄物經拼接后成熟產生,酵母只有很少的基因具有內含子,且無操縱子結構。酵母基因的翻譯效率受基因編碼序列上游DNA序列的影響,一般要求起始密碼子ATG前保留一段短的、不變的前導序列,它對轉錄的起始并非必需,但對mRNA的高效翻譯卻相當重要。(4)酵母作為真核生物的另一特征是能對翻譯產生的前體蛋白質進行加工以產生功能性產物,而且加工往往與分泌作用相偶聯:a.酵母表達載體構建中常用的分泌信號為酵母的MFα1前α一因子前導序列(prepro-2-factor或ppαfl),分泌表達多肽的分子量范圍為24～842個氨基酸,一般不大于30KD,其它分泌信號有:蔗糖酶信號肽、PH05堿性堿酸酶信號序列、黑曲霉糖化酶信號序列,酵母不但能利用自身的分泌信號(較多),也能利用異源的分泌信號;b.酵母有與真核生物相似的表達蛋白加工轉運途徑,在分泌表達時,能正確形成二硫鍵和糖基化加工,外源蛋白在酵母中能發生N—C和O—C連接的兩種不同糖基化,每條糖側鏈平均50～150甘露糖殘基,即存在過度糖基化傾向,且有時在核心多糖末端存在α-1.3糖鏈,從而使得有的糖蛋白呈較高的抗原特性。2.4酵母細胞表達系統的研究,為基因研究提供了基礎1978年Hinnen等及Btggs完成了外源DNA引入酵母原生質體的實驗,酵母2μ質粒及其它載體也相繼完善,酵母轉化技術有了突破,酵母的分子克隆技術及分子遺傳學也迅速深入發展。為了克服大腸桿菌表達系統的缺點,發展了酵母細胞表達系統,它除了對其基礎研究起了很大作用外,也為基因工程藥物和疫苗的產業化做出了巨大的貢獻。現有許多關于細菌、真菌和高等動植物基因在酵母中成功克隆和表達的報道,其中有許多重要蛋白已經應用酵母工程菌進行生產。2.4.1對編碼蛋白表達的調控酵母細胞中基因克隆和表達的載體一般有5種類型(見表1)。其中以2μ環為基礎構建的YEP最常用。表達載體與克隆載體不同的是除復制子和選擇基因外,還需包含表達必須的DNA區段:(1)一個或多個供插入外源蛋白質編碼序列的限制性酶切位點;(2)核心是其上有一個可調控轉錄表達的酵母啟動子;(3)啟動子下游是先導序列(和翻譯效率有關),ATG(起始密碼);(4)往往還含有編碼有用蛋白質結構域的序列:信號肽序列,核定位序列,某種抗原表位或其它標簽蛋白序列。常用的酵母高效表達載體多是YEP類型的質粒,其中包含的酵母強啟動子有PGALI.(半乳糖激酶啟動子)、PPHO(堿性磷酸酶啟動子)、PAPLI(乙醇脫氫酶啟動子)、PPGK(3-磷酸甘油酸激酶啟動子)。啟動子上游往往包含了其上游激活位點(UAS序列)。可誘導啟動子用于質粒編碼蛋白的條件控制性表達,特別是當某基因產物對宿主酵母有毒性時,最好作誘導表達,如PGALI,在培養基含有葡萄糖時,PGALI轉錄活性低(每細胞少于1個轉錄物),而在以半乳糖為唯一碳源的培養基上時,PGALI可大量轉錄。對于PPHO5,當培養基富含無機磷時,PPHO5活性很低,當培養基缺乏無機磷時,則可誘導PPHO5的轉錄活性。組成型啟動子中PADH1最常用,也可用PPDK。隨細胞所處的代謝狀態(生長培養基)的改變,組成型啟動子的活性也可改變,但這種活性的改變沒有誘導的啟動子那么劇烈。2.4.2篩選后轉化體的制備構建好的載體質粒都要通過轉化將外源DNA導入宿主酵母細胞中,再通過篩選操作分離得到轉化體。酵母轉化系統的選擇標記基因(M+)與相對應的突變基因(M-)的菌株配套使用,不同選擇標記有不同的篩選方法(多為營養缺陷互補),轉化方法可分以下兩種。(1)常用快速法a最常用的轉化方法是乙酸鋰轉化法,操作快捷,轉化效率高(可達105～106轉化體/μgDNA),分為一般法和快速法兩種。快速法省時實用,轉化頻率卻較低。在乙酸鋰轉化法中,Li+的最適濃度為100mmol/L,受體酵母濃度為5×107細胞/mL,pH為7.0,為維持高轉化頻率,體系中需加聚乙二醇(PEG4000或PEG3350),乙酸鋰可用硫氰化鋰代替。(2)酵母細胞的分離和制備首先將酵母用酶法去壁成原生質體后再進行外源DNA導入,篩選出的轉化子再使細胞壁再生,操作過程需將原生質體保持在一定合適滲透壓的培養基中。操作步驟多而費時,原生質體非常脆弱,不能直接篩選(藥物),且原生質體可能融合產生多倍體細胞,對依其表型篩選造成困難,而直接法就不存在這些問題。酵母細胞亦可通過電脈沖穿孔法轉化。在酵母轉化過程中,特別是使用乙酸鋰方案時,轉化時添加變性的單鏈相對高分子量單體DNA對提高轉化效率十分重要,一般是將從鮭魚睪丸制取的雙鏈DNAШ鈉鹽用TE溶液溶解并經超聲波處理成2～15kb(最好為平均7kb)的片段,在轉化時同質粒DNA同時加入轉化體系。3外源基因表達數據庫設計不合理,實氧條件下發酵生物酶系統發育釀酒酵母作為一種基因工程表達系統存在一定的局限性:(1)釀酒酵母是一種以發酵為主的酵母,多不適于高密度培養,而大多數外源基因表達需要的是以好氧條件下的營養生長蛋白質合成為條件,用釀酒酵母系統表達外源基因很難達到很高的水平;(2)釀酒酵母缺乏強有力的受嚴格調控的啟動子;(3)釀酒酵母對外源基因表達產物的分泌不夠理想;(4)表達菌株不夠穩定,表達質粒易丟失,此外在翻譯后加工方面也與高等真生物有所不同。3.1甲醇酵母糖苷鏈反應型甲醇酵母(Pichiapastoris)的生物學特點:甲醇代謝的第一步是甲醇在乙醇氧化酶(AOX)作用下被氧化成甲醛。調控AOX的啟動子是強啟動子,用來調控外導源蛋白質的表達,在以葡萄糖或甘油為碳源的培養基上生長時抑制轉錄,而在以甲醇為唯一生長碳源時,誘導基因轉錄,常用的受體菌為GS115,KM71和SMD1168,都為組氨酸缺陷型。甲醇酵母作為真核表達系統的優點:(1)具有強有力的乙醇氧化酶基因(AOXI)啟動子,可嚴格調控外源蛋白的表達;(2)可對表達的蛋白進行翻譯后的加工和修飾,糖基化程度低,糖鏈長度平均每條側鏈為8～14個甘露糖殘基,較之釀酒酵母50～150甘露糖殘基短得多,核心多糖末端不存在a-1.3糖苷鏈;(3)營養要求低,生長快,培養基廉價,便于工業化生產;(4)可高密度發酵培養,表達量高,在發酵罐中細胞干重甚至可達120g/L以上,許多蛋白可達到每升克以上水平;(6)表達的蛋白既可存在于胞內,又可分泌至胞外,Pichia自身分泌的蛋白非常少,十分有利于純化。3.2pasdur表達質粒的篩選P.pasteur質粒主要應用YIP整合性載體,轉化最常用的仍為乙酸鋰法。其轉化體篩選以His,Ura3營養缺陷型篩選為主,特征載體(PPTC3K,PPTC9K)可用抗G418篩選。典型的pasteur表達質粒結構仍為穿梭性載體,載體的一般結構為:(1)5′AOX1,含AOX1啟動子及調控序列,同時也是載體和宿主發生重組的位點;(2)MCS;(3)Sig信號肽;(4)TT轉錄終止和polyA序列;(5)3′AOX1,TT下游區及同源重組位點;(6)篩選標記及E.coli中的克隆基因。為了提高外源基因整合到基因組中的拷貝數,常在表達質粒中串聯幾個“啟動子+外源基因+轉錄終止區”這樣的表達單位,一次整合,即可有多個表達單位插入基因組。4關于研究和應用的期待4.1酵母生物基因篩選工具(1)在生物信息領域,通過對酵母基因組數據庫的檢索、類比分析,在人類基因組研究中已顯示出巨大潛力。在酵母中進行功能互補實驗是一種研究人類基因功能的捷徑,為高等真核生物提供了一個可以檢測的實驗系統,酵母成為其它生物新基因的篩選工具。期望構建的酵母最小基因組將會更加方便和有用。(2)以酵母為主的不斷完善發展的分子生物技術已成為真核分子生物學研究的重要工具。主要包括:酵母單雜交系統(one-hybridSystem),雙雜交系統(two-hybridsystem),逆向雙雜交系統(reversetwo-hybridsystem),三雜交系統(three-hybridsystem),作為研究蛋白質(轉錄因子)與DNA,蛋白質與蛋白質,兩個蛋白質與另外的蛋白、RNA和小分子藥物等相互作用重要的生物體內試驗方法以及篩選順式作用元件等的重要工具。酵母的單倍體-雙倍體可控制生長和產子囊孢子生長特性,為遺傳研究帶來許多方便。4.2酵母基因在食品和發酵工業中的應用各種酵母在生產領域有著廣泛的應用歷史與前景。酵母作為各種特殊蛋白的表達系統,在生產特殊活性肽(疫苗、藥物等)方面已取得成功應用,并且隨著研究的深入還會得到更廣泛的應用,這里僅對酵母基因工程在食品和發酵工業幾個方面的應用作以簡述。4.2.1和sta3國內外最早的研究都集中在對釀酒酵母利用淀粉、寡聚糖和糊精的分泌酶進行基因工程改良上,最早被克隆并引入的是Saccharomylesdiastaticus(糖化酵母,但不耐酒精)的STA1,STA2和STA3,基因引進后以PGK為啟動子,ARS1為復制子,但2μm質粒存在穩定性不好的問題。Yocum(1986)將黑曲霉的葡糖淀粉酶(GA)基因通過YIP整合在酵母染色體上,遺傳穩定性及酶活能滿足生產要求,存在問題是真菌糖化酶耐熱,不能為巴氏滅菌滅活。Schiwaniomycesoccidentacis的GAM1基因整合劑ADH1(乙醇脫氧酶)在基因啟動子下,可達正常工藝要求,生產出低糖(干)啤酒。分泌β-葡聚糖酶可降低啤酒汁粘度,改善過濾性能,該酶基因來自木霉(Trichodermareesci)的EGL1或大麥,分泌融合表達,整合入PPGK1下可改善過濾,不影響持泡特性。4.2.2-羥基丁酮和氨酸丁酮的合成雙乙酰作為啤酒成熟的主要標志,它來自丙酮酸經α-乙酰乳酸合成纈氨酸途徑的副產物,α-乙酰乳酸為雙乙酰的主要前體。通過引入α-乙酰乳酸脫酶(ALDC)基因(來自醋酸桿菌或乳酸菌)整合到酵母的URA3或rDNA上,ALDC則氧化α-乙酰乳酸為3-羥基丁酮,從而達到降低雙乙酰的目的,縮短后熟時間和對纈氨酸生物合成途徑的基因(ILV)克隆和遺傳操作使ILV2缺失,且插入ILV3,使酵母雙乙酰產量明顯降低。啤酒酵母工藝性狀是一個復雜的多基因群體作用,對其聯合綜合改良,是否會超出酵母的生理承受極限,攪亂其自身的遺傳特性,這將是“途徑工程”面臨的新挑戰。4.2.3改良酵母蛋白質酵母細胞營養豐富,一直作為人類及其它動物重要的營養強化劑。按其應用主要分為食用營養酵母(foodyeast)和飼用酵母(feedyeast),具有很大的市場發展空間。酵母作為最重要的單細胞蛋白(SCP)微生物,應用基因工程,改良酵母蛋白質也作了不少工作。Hinch