人組蛋白h1基因克隆及原核表達產物的純化

組蛋白是真核生物染色體的基本結構蛋白，包括a1、a2、b2、h3和h4。p1和其他組的蛋白不同。它們是由非參與核心的蛋白組成的，這些蛋白在建造微體時起連接，并對染色物質給予極性保護。除此之外,組蛋白H1還是細胞周期蛋白依賴性激酶cdc2的底物,而cdc2與周期蛋白B1(cyclinB1)形成的復合物,又稱有絲分裂促進因子(MPF),起著催化細胞從G2期進入M期的作用,因此檢測H1激酶活性已成為反映細胞周期G2/M期激酶活性的常用方法。為了研究G2/M期激酶的調控情況,本研究從人的乳腺文庫中分離出H1組蛋白的全長編碼序列,構建成原核表達載體,誘導并純化H1蛋白,通過激酶實驗檢測其活性,為后續深入研究細胞周期G2/M期的激酶調控奠定了實驗學基礎。1材料和方法1.1菌株和培養基原核表達載體pGEX-KG、大腸桿菌DH5α、Rossate、人乳腺文庫為本室保存。EcoRⅠ和HindIII限制性核酸內切酶、高保真primerSTARDNA聚合酶、T4連接酶為TaKaRa公司產品。GST-Sepharose4B購自Pharmacia;γ-32P-ATP購自北京福瑞生物有限公司;人cyclinB1與cdc2抗體購自Santacruz公司;測序由北京奧科生物技術有限責任公司完成。1.2方法1.2.1pcr擴增hcds序列選取人乳腺文庫作為模板,根據文獻報道的人組蛋白H1CDS序列合成引物。上游引物:5′-CGGGATCCATGTCTGAAACAGTGCCTCCCG-3′;下游引物:5′-CCCAAGCTTTTACTTTTTCTTGGGTGCCGCTT-3′。利用PCR方法擴增H1CDS序列。按以下條件進行H1編碼區全長的擴增:95℃5min;94℃1min,62℃30s,72℃45s共30個循環,72℃7min進行延長,使用高保真primerSTARDNA聚合酶。1.2.2pcr載體的回收用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切pGEX-KG載體,37℃,4h,10g/L瓊脂糖凝膠電泳后,膠回收載體大片段;將PCR片段回收后再用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切,形成帶有黏端的雙鏈,用T4DNA連接酶連接入pGEX-KG載體中。轉化大腸桿菌DH5α,挑選克隆,搖菌并提質粒,用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測序。1.2.3iptg/lm將鑒定正確的重組表達質粒轉化Rossate感受態細胞,挑取菌落,37℃振蕩培養至A600nm=0.6～1.0,加入IPTG至終濃度為1mmol/L,37℃繼續培養4h。離心收集菌體,進行SDS和Westernblot檢測。1.2.4gst融合蛋白的純化將含pGEX-KG-H1和pGEX-KG的Rossate菌接種于含Ampicillin的LB液體培養基中,37℃振蕩培養過夜活化。按10%比例轉種于同種液體培養基中,30℃振蕩培養至A600nm=0.4～0.6,加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L,20℃繼續培養16h。離心收集菌體,按Pharmacia公司提供的方法進行GST融合蛋白的純化:加入裂解液,進行超聲破碎,收集上清,加入適量GST-Sepharose4B,結合4h,離心收集GST-Sepharose4B小顆粒,充分洗脫后未結合蛋白質。利用還原性谷胱甘肽小量多次將GST-H1從珠子上逐漸洗脫,最后以SDS鑒定純化與洗脫蛋白。1.2.5nb1激酶混合物對大鼠蛋白磷酸化的影響由于H1組蛋白是cdc2-cyclinB1激酶復合物的底物,因此利用激酶實驗能夠檢測cdc2-cyclinB1激酶復合物能否使H1組蛋白磷酸化。激酶實驗具體按參考文獻方法操作:使用cyclinB1抗體將細胞中cdc2-cyclinB1復合物進行免疫沉淀,該免疫沉淀物分別與5μgH1組蛋白、5μgGST蛋白以及5μCi-γ-32P-ATP30℃共同孵育30min后,進行SDS以及放射自顯影。2結果2.1in以人乳腺文庫作為模板,按以下條件進行H1編碼區全長的擴增:95℃5min;94℃1min,62℃30s,72℃45s共30個循環,72℃7min進行延長,獲得大小約650bp的PCR產物,與預期片段大小一致(圖1)。2.2克隆位點篩選將PCR產物用BamHI和HindⅢ雙酶切后與用這兩種酶酶切過的pGEX-KG載體連接,轉化大腸桿菌DH5α,挑選的陽性克隆提質粒經酶切鑒定,凝膠電泳可見1條約650bp的條帶(圖2),表明H1基因的CDS序列已插入到pGEX-KG上游的多克隆位點中。DNA序列測定結果顯示,與已知序列完全一致,無突變發生(數據略)。2.3gst-s1融合蛋白的表達將鑒定正確的重組表達質粒轉化Rossate感受態細胞,經過小量誘導后,收集菌體,考馬斯亮藍染色鑒定和Westernblot檢測發現,GST-H1融合蛋白獲得正確表達(圖3)。2.4gst-s1和gst蛋白的分離純化利用GST-Sepharose4B親和珠純化后的融合蛋白,經還原性谷胱甘肽小量多次洗脫,考馬斯亮藍染色結果顯示,獲得一定量純度較高的GST-H1和GST蛋白(圖4)。2.5sds-東南角觀察-32p-atp,sds-東南角觀察將之前洗脫的H1組蛋白、5μgGST蛋白與cdc2-cyclinB1復合物以及γ-32P-ATP共同孵育后,進行SDS和放射自顯影,結果顯示,cdc2-cyclinB1激酶復合物能夠將純化的GST-H1組蛋白磷酸化,但卻不能使GST蛋白磷酸化,說明純化的H1蛋白具有一定的生物學活性(圖5)。3原核表達系統的誘導表達細胞周期蛋白依賴性激酶cdc2,在G2后期cdc2與周期蛋白B1(cyclinB1)結合形成cdc2-cyclinB1復合物,即有絲分裂促進因子(MPF),通過催化作用可使細胞進入和走出M期,在細胞周期調控中起著調控G2至M期的作用。cdc2的過度表達,可使細胞周期進程發生紊亂,以致細胞不能正常生長、分化,當其過表達時往往導致細胞惡性增殖,形成腫瘤。已有大量證據表明,M期細胞周期蛋白與腫瘤的關系是非常密切的,其中cdc2-cyclinB1磷酸化調節機制的缺陷與細胞分化障礙有關,而細胞分化障礙則是腫瘤發生、發展的基本表型。H1組蛋白是cdc2-cyclinB1激酶研究較為經典的底物。研究表明,H1在細胞周期中被cdc2發動的激酶磷酸化,在有絲分裂期時加上4個磷酸基團。因此H1激酶活性已成為檢測細胞周期激酶活性的常用方法,也成為評估G2/M期激酶調控的重要手段。影響大腸桿菌中外源基因表達的因素很多,如表達載體的選擇,外源基因中密碼子的使用,mRNA的一級和二級結構的作用,mRNA穩定性的影響,宿主的選擇及培養條件的控制等。本試驗中采用了融合蛋白高效表達載體pGEX-KG,該載體的優點是將外源蛋白基因置于載體蛋白GST基因后邊,可以減少真核基因中大腸桿菌稀有密碼子對蛋白表達的影響,可以誘導目的蛋白穩定、高效表達,在體外易于純化,其中最為突出的優點是可以將結合在珠子上的融合蛋白用還原性谷胱甘肽洗脫下來,即可獲得具有活性的目的蛋白。但是,我們在試驗中也發現該系統仍存在幾個問題:一是細菌蛋白酶對外源性表達產物的分解。電泳中發現除誘導產物帶外,也存在降解帶,說明存在著蛋白酶的分解問題,這一問題可通過更換蛋白酶缺陷性的宿主菌得到改善。另一個問題是表達的融合蛋白的凝集和包含體的形成。因此,為了減少包含體的形成,我們降低了誘導溫度,即在30℃低溫誘導,并減少IPTG的濃度(終濃度為0.1mmol/L),結果在