米曲霉產糖化酶培養(yǎng)條件優(yōu)化研究

“小麥酒和酒精”是中國黃酒的特點。這是中國古代工人根據長期積累的寶貴經驗提出的一項偉大的發(fā)明。麥曲是以小麥為主要原料，在開放式的制曲過程中，通過自然培育，富集環(huán)境中的有益微生物而形成的復雜體系。在黃酒發(fā)酵中，麥曲作為復合糖化發(fā)酵粗酶制劑，同時具有生香、增味、成色的多種功能，其質量的優(yōu)劣直接影響到黃酒的質量和產量，其內在品質與黃酒品質之間相輔相成。成品麥曲中糖化酶活性的高低是目前衡量麥曲質量的一個重要指標，也是影響出酒率的關鍵因素。黃酒企業(yè)為了保證成品麥曲的糖化酶活性，采用麩皮培養(yǎng)基對米曲霉進行純種培養(yǎng)獲得高糖化酶活性的麩曲，而后將麥曲和麩曲按一定比例混合，然后用于黃酒釀造。所以高糖化酶活性的麩曲對黃酒生產顯得很重要。米曲霉是一種既能產糖化酶也能產液化酶的絲狀真菌。日本清酒生產用的米曲就是以純種米曲霉培養(yǎng)而成的，它的作用是將淀粉轉化為可發(fā)酵糖。中國黃酒生產中所用的純粹培養(yǎng)麥曲也以米曲霉(大多采用米曲霉蘇-16)為生產菌種。因此，獲得高產糖化酶的菌種以及對其產酶條件進行優(yōu)化顯得十分重要。響應面法(responsesurfacemethodology,RSM)是一種優(yōu)化生物過程的綜合技術，采用該法可以建立連續(xù)變量曲面模型，可同時對影響生物產量的各因素水平及其交互作用進行優(yōu)化與評價，因此它可快速有效地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件。目前該法已經廣泛地應用于各類培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件的優(yōu)化實踐中。本實驗主要采用RSM法，對影響米曲霉產糖化酶活性的一些關鍵因素進行研究。1材料和方法1.1zeaao-1的ao-1麩皮、馬鈴薯市場購買。米曲霉(A.oryzae)AO-01為本課題組從黃酒麥曲中分離篩選所得。醋酸鈉、醋酸、可溶性淀粉、氫氧化鈉、碘、碘化鉀、硫酸和硫代硫酸鈉。1.2設備和技術指標LRH-250型生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；TGL-16C型臺式高速離心機上海安亭科學儀器廠；1086型精密水浴鍋德國GFL公司；HYG-II型迴轉式恒溫調速搖瓶機上海新星自動化控制設備成套廠；UV-2100型紫外分光光度計UNICO(上海)儀器公司；LS-350L型立式壓力蒸氣滅菌鍋上海醫(yī)用核子儀器廠；MP2000D型電子天平精科儀器(上海)有限公司；DG-2B多功能恒溫箱上海醫(yī)療器械修造廠；超凈工作臺蘇凈集團安泰公司。1.3瓊脂糖添加量斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂15g/L,pH自然。麩皮培養(yǎng)基：麩皮:水=1:1。培養(yǎng)基均采用0.1MPa下滅菌20minㄢ1.4方法1.4.1培養(yǎng)條件確定孢子懸浮液制備：取30℃培養(yǎng)3d的試管斜面菌種，加入無菌生理鹽水洗下孢子，無菌條件下過濾至帶玻璃珠的無菌三角瓶中搖勻，血球計數板計數，將孢子濃度調至106個/mlㄢ固態(tài)發(fā)酵：取1ml孢子懸浮液接入麩皮培養(yǎng)基中，置30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔4h搖瓶一次。1.4.2酶溶液的制備固態(tài)發(fā)酵后，向麩曲中加入生理鹽水，于30℃、120r/min振蕩浸提1h。三層紗布過濾，所得濾液用于測定糖化酶酶活。1.4.3糖化酶的測定按參考文獻測定糖化酶活性，結果用U/g干曲表示。1.5實驗設計1.5.1單因素影響測試主要考察培養(yǎng)時間(h)、溫度(℃)、固水比等因素對糖化酶活性的影響。每個試驗進行三次重復，取其平均值進行分析。1.5.2box-behnkenlh模型Box-Behnken模型設計法每個因素取三個水平，根據相應的實驗表進行實驗后，對數據進行二次回歸擬合，得到包括一次項、平方項和交互項的二次方程，分析各因素的主效應和交互效應，最后在一定水平范圍內求取最佳值。采用Box-Behnken模型，以糖化酶活性為響應值，培養(yǎng)時間(h)，溫度(℃)，固水比這三個外界因子為自變量，分別以X1、X2、X3來表示，并以編碼值+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平(見表1)，且真實值與編碼值符合方程(1)。該模型通過最小二乘法擬合的二次多項方程為：式中，Y為預測響應值；Xi和Xj為自變量編碼值；C0為常數項；Ai為線性系數；Bij為二次系數；n為因子數，本實驗中為3。按照Box-Behnken試驗設計的統(tǒng)計學要求，對方程(2)中各項回歸系數需要15組試驗。采用SAS(Version8.0)對試驗數據進行回歸分析。采用SAS典型性分析預測米曲霉(A.oryzae)AO-01產糖化酶的最佳發(fā)酵條件以及最大值。2結果與分析2.1單因素試驗和發(fā)酵條件2.1.1不同培養(yǎng)時間對糖化酶活性的影響在培養(yǎng)溫度為30℃、固水比1:1條件下，考察培養(yǎng)時間對糖化酶活性的影響。不同培養(yǎng)時間對A.oryzaeAO-01產糖化酶的影響如圖1。由圖1可見，在時間低于33h時糖化酶升高比較明顯，以后逐漸下降。在第33h酶活性最高，達到1359.4U/g干曲。這表明，糖化酶活性與培養(yǎng)時間密切相關。時間過短，糖化酶產出不夠，而時間過長又會影響糖化酶的活力，使其活力降低。2.1.2培養(yǎng)溫度對糖化酶活性的影響在固水比為1:1，培養(yǎng)時間30h，研究不同培養(yǎng)溫度(25～35℃)對A.oryzaeAO-01產糖化酶的影響，結果如圖2所示。溫度是影響微生物生長以及酶活力的最重要的因素之一。從本實驗所選擇的培養(yǎng)溫度可以看出，溫度為25℃時，糖化酶活力約為1000U/g干曲。隨著培養(yǎng)溫度的提高，酶活逐漸增高，當培養(yǎng)溫度為33℃時，糖化酶活性最高，達到1398.2U/g干曲。但溫度過高糖化酶活力稍有降低，可能是因為高溫條件下酶失活的結果，這與大多數酶活力測定結果一致。2.1.3aeao-2011產糖化酶的變化在固定溫度33℃、培養(yǎng)時間33h的條件下，改變不同的固水比，研究固水比對A.oryzaeAO-01產糖化酶的影響，結果見圖3。麥曲中微生物的產酶均屬于固態(tài)發(fā)酵過程。因此，發(fā)酵過程中水的用量是影響微生物產酶的重要因素。從圖3中可以看出，固水比的增加對糖化酶活力有明顯的效果，當固水比在1:1.2時，酶活最高，達到1431.5U/g干曲。2.2糖化酶活性的顯著性通過單因素試驗發(fā)現：培養(yǎng)時間、溫度和固水比對A.oryzaeAO-01產糖化酶的酶活均有影響。根據BoxBehnken的中心組合試驗設計原理，做三因素三水平的響應面分析試驗，試驗設計及結果見表2。1～12組為析因試驗，13～15組為中心試驗，用來估計試驗誤差。利用SAS軟件，通過表2中糖化酶試驗數據對方程(2)進行多元回歸擬合，可以得到糖化酶活性對編碼自變量發(fā)酵時間、溫度和固水比的二次多項式方程：從表3對模型的方差分析結果可見，本實驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性(Pmodel=0.002535)，其校正決定系數R2adj為91.81%，表明只有約9%的糖化酶活性總變異不能由此模型進行解釋。相關系數R2為97.07%，表明糖化酶活性的實測值與預測值之間具有較好的擬合度。從表3可以看出，發(fā)酵時間和固水比對糖化酶活性的曲面效應顯著，培養(yǎng)溫度不顯著；培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度的交互作用影響不顯著，而其它兩兩交互作用均顯著；線性影響效應中發(fā)酵時間和固水比顯著，而培養(yǎng)溫度不顯著。通過方程(3)所作的曲面圖和等高線圖如圖4～6所示。每張等高線圖中都含有一個中心點，說明在實驗設計時所選的因素水平較合理。此外，各因素及其交互作用對響應值的影響結果可通過圖直觀反映出來，圖中等高線的形狀反映出交互效應的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則與之相反。圖4顯示了固水比位于中心水平時(X3=0)，培養(yǎng)時間與培養(yǎng)溫度對糖化酶活性的交互影響。從其等高線圖可以直觀地看出此兩因素的交互作用不顯著。當培養(yǎng)溫度處于中心水平時(X2=0)，培養(yǎng)時間和固水比對糖化酶活性的交互影響見圖5。可以看出這兩因素的交互作用對糖化酶活性的影響顯著。由圖6可見，當培養(yǎng)時間處于中心水平時(X1=0)，培養(yǎng)溫度和固水比對糖化酶活性具有較強的交互作用。擬合方程(3)對X1、X2、X3分別求偏導，可以得到模型的極值，即為最大的糖化酶活性。解方程(3)，得到最大值Y1=1625.4，此時編碼值X1=-0.0647,X2=-0.665,X3=0.744。預測糖化酶的最大酶活為1625.4U/g干曲時，對應的培養(yǎng)條件：發(fā)酵時間32.8h，培養(yǎng)溫度31.2℃，固水比1:1.24ㄢ2.3糖化酶發(fā)酵條件優(yōu)化為了驗證預測值，用以上得到的最優(yōu)培養(yǎng)條件重復實驗三次，結果分別為：1588.2、1563.9、1645.1U/g干曲，平均為1599.0U/g干曲，與預測值有較好的擬合性，證明了響應曲面法優(yōu)化糖化酶發(fā)酵條件的可行性。在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，最高酶活1645.1U/g干曲，比實驗設計中的最低酶活656.2U/g干曲提高了1