一、核酸核苷酸單體聚合而成的生物大分子，是生物細胞最基本和最重要的成分。普通認為，生物進化即始于核酸，由于在全部生命物質(zhì)中只有核酸能夠自我復(fù)制。今天已知核酸是生物遺傳信息的貯藏所和傳遞者。一種生物的藍圖就編碼在其核酸分子中。核酸是1869年米歇爾(F.Miescher)在膿液的白細胞中發(fā)現(xiàn)的。他當(dāng)時稱之為核素。阿爾特曼(R.Altmann)于1889年認識其酸性后，定名為核酸。二、核酸的分類和功效核酸分為核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)兩大類。這兩類核酸有某些共同的構(gòu)造特點，但生物功效不同。DNA貯存遺傳信息，在細胞分裂過程中復(fù)制，使每個子細胞接受與母細胞構(gòu)造和信息含量相似的DNA；RNA重要在蛋白質(zhì)合成中起作用，負責(zé)將DNA的遺傳信息轉(zhuǎn)變成特定蛋白質(zhì)的氨基酸序列。核酸的基本構(gòu)造單元是核苷酸，核苷酸含有含氮堿基、戊糖和磷酸3種組分。堿基與戊糖構(gòu)成核苷，核苷的磷酸酯為核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含D-2-脫氧核糖(核糖中2位碳原子上的羥基為氫所取代)。核酸就是根據(jù)其中戊糖種類來分類的，DNA和RNA的堿基也有所不同。三、核酸的理化性質(zhì)RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥苷酸含有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，普通都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離核酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達40g/L，DNA鈉鹽在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。天然狀態(tài)的DNA

是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細胞核中。要從細胞中提取DNA

時，先把DNP抽提出來，再把P除去，再除去細胞中的糖，RNA

及無機離子等，從中分離DNA。四、細胞裂解：（一）裂解原理在核酸提取過程中，細胞裂解是非常重要的。典型的裂解液幾乎都含有去污劑

(如

SDS、TritonX-100、NP-40、Tween20

等)

和鹽

(如

Tris、EDTA、NaCl

等)。鹽的作用，除了提供一種適宜的裂解環(huán)境

(如

Tris)，還涉及克制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞

(如

EDTA)、維持核酸構(gòu)造的穩(wěn)定

(如

NaCl)

等。去污劑則是通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜構(gòu)造及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶，運用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，增進核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時，也便于背面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑

(如

GIT、GuHCl

等)

裂解的，該辦法已經(jīng)成為了

RNA

抽提的主流，卻不是基因組

DNA

抽提的主流。（二）細胞的裂解辦法細菌細胞破碎辦法有下列幾個：1）機械辦法：超聲波解決法、研磨法、勻漿法。有關(guān)超聲波解決法，要設(shè)定好超聲時間和間隙時間，普通超聲時間不超出5秒，間隙時間最佳不不大于超聲時間。2）化學(xué)試劑法：用含SDS或CTAB的溶液解決細胞，在一定的pH環(huán)境和變性條件下,細胞破裂,蛋白質(zhì)變性沉淀,核酸被釋放到水相，pH環(huán)境則由加入的強堿(NaOH)或緩沖液(TE、STE等)提供，表面活性劑或強離子劑可使細胞裂解、蛋白質(zhì)和多糖沉淀,緩沖液中的某些金屬離子螯合劑(EDTA等)可螯合對核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+

、Ca2+,從而克制核酸酶的活性,保護核酸不被降解。3）重復(fù)凍融法：將細胞在-20度下列冰凍，室溫融解，重復(fù)幾次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引發(fā)溶脹，使細胞構(gòu)造破碎。個人經(jīng)驗普通狀況，37℃,3min，液氮3min,重復(fù)三次即能夠。4）酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶、蛋白酶K等，都可使細胞壁破碎，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì),增進核酸的分離。其中溶菌酶能催化細菌細胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-(1,4)

鍵水解。蛋白酶K能催化水解多個多肽鍵,其在65

℃及有EDTA、尿素(1～4mol/L)

和去污劑(0.5%SDS

或

1%TritonX-100)

存在時仍保存酶活性,這有助于提高對高分子量核酸的提取效率。在實際工作中,酶作用、機械作用、化學(xué)作用經(jīng)常聯(lián)合使用。具體選擇哪種或哪幾個辦法可根據(jù)細胞類型、待分離的核酸類型及后續(xù)實驗?zāi)康膩頂M定。（三）裂解辦法的評價含蛋白酶的裂解辦法，能夠認為是抽提基因組

DNA

的首選。裂解涉及膜蛋白的游離和與基因組

DNA

相連接的蛋白質(zhì)的游離。蛋白酶的作用是使蛋白質(zhì)變小，故而對蛋白質(zhì)的游離有巨大的增進作用；同時，巨大的基因組DNA

是很容易“纏”住大分子的東西的，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后，則不容易被基因組

DNA“纏”住，有助于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除，使最后獲得的基因組

DNA

的純度更高。另外一種思路是，如果基因組

DNA

與蛋白質(zhì)

“纏”在一起，在純化的過程中有兩種可能：如果基因組

DNA

的特性占優(yōu)勢，則純化時以

DNA

的形式被保存下來，造成蛋白質(zhì)的殘留；如果蛋白質(zhì)的特性占優(yōu)勢，則純化時以蛋白質(zhì)的形式被去除，造成

DNA

的損失。固然去污劑裂解辦法，仍然在細胞基因組

DNA

抽提方面有優(yōu)勢，特別是當(dāng)?shù)寐屎图兌纫?guī)定不是最高，而經(jīng)濟性及操作簡樸很重要時。控制好裂解液/樣品的比例是該辦法成功的核心。該辦法結(jié)合高鹽沉淀，能夠?qū)崿F(xiàn)最簡樸的操作，但純度及得率的穩(wěn)定性可能會比用PC抽提的差某些。高濃度蛋白質(zhì)變性劑

(如

GIT、GuHCl

等)

的裂解辦法，是抽提

RNA

的首選。總

RNA

的抽提，最重要的是快速裂解細胞膜，至于與基因組

DNA

相連接的蛋白質(zhì)的裂解以及基因組與蛋白質(zhì)

“纏”住的問題，由于都不會對后來的純化產(chǎn)生大的影響，能夠不考慮。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細胞膜，進而快速克制住細胞內(nèi)的

RNA

酶，從而確保了

RNA

的完整性。除了極少量不合用該辦法的樣品

–

重要是植物，其它絕大部分樣品的

RNA

的抽提，都能夠以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎(chǔ)的。固然有些樣品，如肌肉，即使是

RNA

抽提，也強烈建議使用含蛋白酶的裂解液

(或者在操作中的某個時候使用蛋白酶消化蛋白質(zhì))

，因素在于這些樣品中的蛋白質(zhì)，是非常難以去除的。該辦法是獲得最大得率和最高純度的基礎(chǔ)。含

CTAB

的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細菌、植物的基因組

DNA

抽提的首選裂解辦法。該辦法成功與否與兩個因素有關(guān)：一是CTAB

的質(zhì)量，二是洗滌的徹底程度。CTAB

的質(zhì)量對裂解效率有很大的影響，并且，似乎還說不清晰因素，由于即使是同一公司生產(chǎn)的純度同樣的

CTAB，批號不同，效果就可能差別很大。洗滌去除

CTAB

要比其它的鹽難某些，同時，CTAB

的少量殘留也會對酶活性有巨大影響，因此洗滌與否徹底也是該辦法成功與否的核心。裂解時的溫度，多使用

65C；但如果發(fā)現(xiàn)降解嚴重或者得率太低，能夠試一下

37C–45C

這個相對低溫的區(qū)域。SDS

堿裂解法是質(zhì)粒抽提的首選裂解辦法，含有快速、得率高、幾乎無基因組

DNA

污染的特點。控制好裂解液/菌體的比例和操作的溫和是該辦法成功的核心。蛋白質(zhì)的沉淀效率在4℃會更加好某些，因此，加入溶液后在

4℃靜置一段時間以及采用

4℃離心去蛋白質(zhì)，都能夠提高質(zhì)量。該辦法不一定要使用

PC

純化，但結(jié)合

PC

純化，能夠獲得純度很高的質(zhì)粒。RNA

的去除能夠靠在溶液中加入

RNaseA(100ug/ml)

或者在最后的溶解液中加入

RNaseA(25ug/ml)

來實現(xiàn)。總的感覺是，在溶液中使用

RNaseA，RNA

的殘留少某些。但是，典型沉淀幾乎沒有方法徹底去除

RNA

殘留。另外，對大質(zhì)粒

(50kb

以上)，該辦法可能會有問題。PCR

模板的簡易裂解辦法，也是使用面很廣的一類辦法。該辦法的特點是不必純化，樣品被裂解后即可直接取裂解液用于

PCR，非常快速。也正由于不純化，因此，假陰性

(即沒有擴增出來的陽性)

比例也比較高。該辦法最簡樸的就是重復(fù)凍融法，簡便快捷，不需任何化學(xué)試劑，凍融離心，PCR檢測就能夠了。如果使用裂解法，那么最簡樸的裂解液就是水，復(fù)雜一點的就會含有某些不會克制后續(xù)的

PCR

反映，并且能提高裂解效率，甚至還可能部分消除樣品內(nèi)克制

PCR

反映雜質(zhì)的東西，如

TritonX-100、甲酰胺等。再復(fù)雜一點的就會含有諸如

Chelex100

之類的能吸附部分雜質(zhì)的介質(zhì)。操作也非常簡樸，多使用溫度的變化來實現(xiàn)樣品的裂解，如煮沸、或者高溫-低溫的多次循環(huán)等。該辦法最適合從一大堆樣品中找出陽性樣品，但卻不合用于判斷某一種樣品是陽性還是陰性。減少樣品使用量能夠提高陽性率，由于樣品量的減少，同時意味著

PCR

的克制物量的減少。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將造成沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質(zhì)的過程復(fù)雜且不徹底，造成純度下降。另外，裂解液的用量是以樣品中蛋白質(zhì)的含量為基準的，而不是以核酸含量為基準，這一點務(wù)必切記。五、核酸純化就個人所知，現(xiàn)在在科研領(lǐng)域廣泛使用的核酸純化技術(shù)重要能夠分為兩大類：使用介質(zhì)的和不使用介質(zhì)的，使用介質(zhì)的，一次就將核酸與其它全部雜質(zhì)分開；不使用介質(zhì)的，一定是首先將核酸和鹽與大分子雜質(zhì)分開，再通過沉淀核酸使核酸與鹽分開

(PEG

沉淀和

LiCl

沉淀除外)。1）典型的使用苯酚/氯仿抽提的純化技術(shù)：細胞裂解后離心分離含核酸的水相，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25

∶24

∶1

體積)

混合液。根據(jù)應(yīng)用目的，兩相經(jīng)漩渦振蕩混勻(合用于分離小分子量核酸)

或簡樸顛倒混勻(合用于分離高分子量核酸)

后離心分離。疏水性的蛋白質(zhì)被分派至有機相，核酸則被留于上層水相。酚是一種有機溶劑，預(yù)先要用STE

緩沖液飽和，因未飽和的酚會吸取水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發(fā)黃,而氧化的酚可引發(fā)核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián)；故在制備酚飽和液時要加入一特殊物質(zhì)，以避免酚氧化。氯仿可去除脂肪，使更多蛋白質(zhì)變性,從而提高提取效率。異戊醇則可減少操作過程中產(chǎn)生的氣泡。核酸鹽可被某些有機溶劑沉淀,通過沉淀可濃縮核酸,變化核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質(zhì)分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在含核酸的水相中加入pH5.0～5.5

，終濃度為0.3M的NaAc

或KAc

后，鈉離子會中和核酸磷酸骨架上的負電荷，在酸性環(huán)境中增進核酸的疏水復(fù)性。然后加入2～2.5

倍體積的乙醇,經(jīng)一定時間的孵育，可使核酸有效地沉淀。其它的某些有機溶劑（異丙醇、聚乙二醇(PEG)

等）和鹽類(10.0mol/L

醋酸銨、8.0mol/L

的氯化鋰、氯化鎂和低濃度的氯化鋅等)

也用于核酸的沉淀。2）使用離子交換介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱，核酸被聯(lián)結(jié)在離子交換介質(zhì)上；洗滌去除殘留的雜質(zhì)后，用高鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來。再通過原則的乙醇/異丙醇沉淀、乙醇洗滌、干燥等操作，獲得純的核酸，溶解于適宜的緩沖液中。3）使用吸附介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱，核酸被吸附介質(zhì)選擇性吸附；洗滌去除殘留的雜質(zhì)后，用水或者適宜的低鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來，就能夠直接用于后續(xù)實驗。4)

密度梯度離心法：密度梯度離心也用于核酸的分離和分析。雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA

和蛋白質(zhì)含有不同的密度，因而可經(jīng)密度梯度離心形式形成不同密度的純樣品區(qū)帶，該法合用于大量核酸樣本的制備，其中氯化銫2溴化乙錠梯度平衡離心法被認為是純化大量質(zhì)粒DNA

的首選辦法。氯化銫是核酸密度梯度離心的原則介質(zhì),梯度液中的溴化乙錠與核酸結(jié)合，離心后形成的核酸區(qū)帶經(jīng)紫外燈照射，產(chǎn)生熒光而被檢測，用注射針頭穿刺回收后，通過透析或乙醇沉淀除去氯化銫而獲得純化的核酸。（二）純化辦法評價PC(P是英文酚的縮寫，C是英文氯仿的縮寫)抽提/醇沉淀辦法，是一種永但是時的辦法。穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟、方便。PC抽提能夠徹底去除蛋白質(zhì)，醇沉淀能夠去除鹽，對于普通的干凈的樣品

(雜質(zhì)為蛋白質(zhì))，該辦法完全能夠獲得高質(zhì)量的核酸。即使每次

PC

抽提都會損失一部分核酸

(由于不可能將水相全部移取)，以及低濃度核酸的醇沉淀效率低，但這些問題都能夠靠操作的調(diào)節(jié)而得以解決或者減少影響。該辦法的最大的問題是不適合大規(guī)模抽提。PC抽提是去除蛋白質(zhì)的一種非常有效的手段。苯酚能使蛋白質(zhì)變性，變性后的蛋白質(zhì)從水相中被析出，處在苯酚中或者苯酚/水相之間。PC

抽提的核心是，一要混勻徹底，二要用量足夠。徹底混勻，才干確保苯酚與蛋白質(zhì)的充足接觸，使蛋白質(zhì)完全變性。許多人總是緊張混勻的激烈程度與否會對核酸，特別是基因組

DNA

造成破壞，事實上大可不必如此小心。激烈的混勻操作，是會部分打斷大分子的基因組

DNA，但該破壞作用不會強烈到

DNA

變成

10kb

以內(nèi)的小片段。手激烈晃動混勻后，基因組

DNA

的片段，大部分會不不大于

20kb，這個大小，除了某些特別的規(guī)定外，對

PCR

和酶切，都是完全合用的。如果規(guī)定的片段非常大，如構(gòu)建文庫用，則不能使用激烈的混勻辦法，而只能來回溫和顛倒混勻

–

此時的核心是：裂解液的比例要足夠大，使體系不要太粘稠。用量要足夠，是由于苯酚去除蛋白質(zhì)是有一定的飽和度的。超出了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會被一次去除，必須靠多次抽提，方可徹底去除。另外，體系太粘稠的害處是，蛋白質(zhì)難以徹底去除，以及基因組

DNA

會斷裂得更厲害，因此要注意裂解液與樣品的比例。4℃離心操作有助于更徹底去除蛋白質(zhì)。PC抽提的另外一種用途是，運用酸性酚能夠部分去除

DNA

的特點，在

RNA

抽提時獲得

DNA

殘留極少的

RNA。但是有一點要提示的是，有些植物樣品，在去除某些雜質(zhì)之前，是不能使用

PC

抽提的，否則核酸必然降解。高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀辦法，同樣也是一種非常不錯的辦法。與

PC

抽提辦法相比，除了純度的穩(wěn)定性可能要低一點外，該辦法幾乎克服了

PC

抽提的全部缺點。更快、更輕松去除蛋白質(zhì)所隨著的好處是，能夠用于大規(guī)模抽提，局限性是純度

(蛋白質(zhì)殘留)

不夠穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的沉淀效率在

4℃會更加好某些。介質(zhì)純化辦法，是一種越來越受到重視的辦法。其最大特點是非常適合大規(guī)模核酸抽提，并且由于受人為操作因素影響小，純度的穩(wěn)定性很高

(即使純度不一定比PC

純化辦法更高)。其致命弱點是樣品過量。介質(zhì)能夠分為兩大類，一類是柱式的，即介質(zhì)被預(yù)先裝填在下面是通的柱子里；另外一類則是顆粒狀

(如Glassmilk、磁性小珠等)。顆粒狀的介質(zhì)的純化操作與典型的醇沉淀差別不大，都是通過多次的加液-倒液過程，干燥后，溶解即可獲得純化好的核酸。柱式純化的操作即使也是有加液-倒液過程，但由于加入的液體通過離心后會進入另外一種離心管中，與含有核酸的柱子完全是分開的，因此洗滌更徹底，操作更省力

(不用操心將核酸倒掉了，或者液體的殘留)。但是，介質(zhì)純化辦法的成本是最高的。（三）醇的沉淀1）沉淀的原理目的：目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì)–重要是鹽的分離。就核酸而言，原則的醇沉淀規(guī)定有一定的鹽及某一比例的醇用量，但這決不是說這些鹽是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。實際操作中不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)裂解體系中核酸的濃度達成一定水平后，即使體系中不含教科書中建議的鹽，單獨使用醇也能夠使核酸沉淀下來；或者含有鹽，使用低比例的醇也能夠使核酸沉淀下來

(固然，得率可能會減少)。懂得這一點的意義在于：不要迷信原則辦法的唯一性；相反，當(dāng)使用原則辦法碰到問題

–

重要是純度問題時，完全能夠通過調(diào)節(jié)沉淀條件來改善。最有參考價值的是的一種沉淀方案：二分之一異丙醇加二分之一高鹽溶液替代純正的異丙醇，能夠大大減少多糖殘留。另外一種問題就是，要堅信核酸的醇沉淀過程同樣也是其它雜質(zhì)的沉淀過程；調(diào)節(jié)醇沉淀的條件，即使會減少核酸的得率，但由于能夠大大提高純度。2)

沉淀劑的選擇：醇沉淀使用異丙醇還是乙醇，我們并沒有發(fā)現(xiàn)這兩者對質(zhì)量有大的影響。異丙醇沉淀的核酸比較緊湊，帖壁緊，顏色不是很白；乙醇沉淀的核酸比較蓬松，容易從壁上移動，顏色比較白。這是現(xiàn)象，少量核酸用異丙醇沉淀，大量核酸用乙醇沉淀。至于異丙醇沉淀更容易沉淀下鹽的說法，我們沒有碰到過，我更覺得出現(xiàn)該現(xiàn)象的因素就在洗滌的不徹底。固然，也不要忘記異丙醇沉淀的最大優(yōu)點是體積小，能夠使絕大部分的小量抽提操作在

1.5ml

離心管內(nèi)完畢。但由于其沉淀物很緊湊，洗滌時其中心部分不容易被洗滌到，因此，洗滌異丙醇沉淀的核酸的核心是：一定要使沉淀懸浮起來，一定要放置一段時間使沉淀最后變成蓬松的白色。如果再洗滌一次，質(zhì)量決不會有問題的。固然，沉淀所用的試劑，不僅僅就乙醇和異丙醇，尚有涉及PEG、LiCl、CTAB

都能夠用于核酸沉淀，即使它們遠沒有醇沉淀的高使用頻率，但卻各有特點。LiCl

能夠沉淀

RNA

以去除

DNA，CTAB

能夠從含多糖的裂解體系中將核酸沉淀下來。PEG

是沉淀病毒顆粒的方便手段。3)

沉淀溫度的選擇：如果核酸抽提的起始樣品是雜質(zhì)比較多時，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當(dāng)核酸濃度很低時，效果明顯；當(dāng)核酸濃度比較高時，效果不明顯，但卻會造成雜質(zhì)的大大增加。（四）核酸的洗滌1）洗滌原理與目的：洗滌對于整個提取過程來說，也是非常重要的。洗滌，首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要控制一定的時間，特別是當(dāng)核酸沉淀比較大時

(使核酸沉淀最后蓬松)；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。大部分資料中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水紙上半晌”，這一說法，對于質(zhì)量好的離心管，如果離心管是通過硅化的，由于液體幾乎不掛壁，因此上清能夠去除得非常徹底；好的管子，即使沒有通過硅化，殘留量也非常少，也沒有什么問題；差的管子，液體的掛壁非常可觀，其殘留量多到會影響后續(xù)的實驗。避免液體殘存的一種好辦法，就是倒掉液體后再短暫離心，將殘液用移液器吸出。尚有需大家切記的是，殘液中都含有上一步操作中的雜質(zhì)，其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關(guān)。揮發(fā)時去掉的是乙醇，雜質(zhì)是不會被揮發(fā)去除的。這步，切忌不要用手甩，這樣容易將核酸甩掉。另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越強，洗滌越要徹底：放置時間相對要長一點，洗滌次數(shù)也要考慮增加。固然，乙醇濃度的選擇也非常重要，普通狀況，洗滌一定要用室溫的

75%

乙醇。（五）核酸的溶解和保存

1）核酸溶解：純化后的核酸，其中

RNA

以水溶解為主，DNA

則多以弱堿性的

Tris

或者

TE

溶解。典型的

DNA

溶解辦法多倡導(dǎo)使用

TE

溶解，其中因素是有人認為

EDTA

能夠減少

DNA

被可能殘留下來的

DNase

降解的風(fēng)險；如果操作過程控制得當(dāng)，DNase

的殘留幾乎是能夠無視的，完全能夠直接使用

Tris

或者水

(pH

靠近

7)

溶解

DNA。2）核酸保存：基本上，核酸在保存中的穩(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比。普通的我們選擇，-20℃或70℃保存的穩(wěn)定。如果溫度不適宜，保存中核酸發(fā)生降解或者消失，首要因素是酶殘留造成的酶解，第二個因素則是保存核酸溶液的

pH

值不適宜造成的水解(RNA

在弱酸性更穩(wěn)定，而

DNA

在弱堿性更適宜)。尚有一種不為人重視的，就是EP

管對核酸的影響。首先一定要堅信一點，那就是核酸一定會與裝它的容器的接觸面發(fā)生反映，達成某種均衡。EP

管的材質(zhì)，首先可能吸附核酸，另首先還能夠誘導(dǎo)核酸的構(gòu)造發(fā)生某些變化，如變性。在核酸的濃度比較高時，這個現(xiàn)象可能觀察不到；當(dāng)核酸濃度很低時，則比較明顯了。在低濃度的核酸中加入

Geletin,Glycogen,BSA

能夠穩(wěn)定核酸，即使已經(jīng)為實驗所證明，但許多實驗人員并沒有將該建議當(dāng)回事。現(xiàn)在制造

EP

管的材料遠多于過去。這些新出現(xiàn)的材料，在強度、透明度等物理特性方面可能比原來的純

PP

材質(zhì)要好許多，但其化學(xué)特性，特別是對核酸穩(wěn)定性的可能影響，遠沒有研究透徹。正如現(xiàn)在的質(zhì)粒能夠改造得越來越合用某些規(guī)定同樣，其負面產(chǎn)物可能是，抽提的質(zhì)粒電泳的構(gòu)型越來越多：除了原來的三種帶型外，還可能出現(xiàn)

denaturedcc

、multimericformsofcc

等等帶型。（六）核酸的濃縮應(yīng)用最廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中檔濃度單價陽離子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可經(jīng)離心而回收，甚至對低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需濃度，再溶于適宜的緩沖液中。核酸濃縮的具體操作時，可向含樣品的小離心管中加入V/10單價陽離子鹽貯存液2V無水乙醇，混勻，放冰水浴中15～30min，取出目測平衡，0～4度，1g，離心10min。吸棄上清，再另70%乙醇0.5～1ml，1g，0～4度洗滌離心2min。吸棄上清，沉淀用油泵抽干或打開蓋子晾干后，溶于適宜體積的緩沖液中。單價陽離子鹽的選擇，重要基于下述考慮：用醋酸銨可減少dNTP的共沉淀，但在后來要作核酸的磷酸化時應(yīng)避免用醋酸銨，因銨離子是T，多核苷酸激酶的強烈克制劑。當(dāng)用較高濃度的乙醇沉淀RNA時，慣用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不隨核酸共沉淀。含有SDS的核酸樣品，應(yīng)使用NaCl，這時該去垢劑要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸鈉（pH5.2

）。六、核酸質(zhì)量的檢測問題將抽提好的核酸直接用于后續(xù)的實驗，是唯一可靠的檢測辦法；除此之外的檢測辦法，都是相對的，并且并不十分可信。現(xiàn)在用于正式實驗前檢測核酸質(zhì)量的辦法，一是電泳，二是紫外分光光度儀。電泳檢測的重要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大

(超出電泳分離范疇)，該辦法還是非常可信的；電泳還能夠用于預(yù)計核酸的濃度，但其精確度與經(jīng)驗有關(guān)；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是同樣與經(jīng)驗有關(guān)。紫外分光光度儀檢測的是純度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度儀不能確保非常精確，而該儀器的敏捷度又非常高，因此，提供的成果并不十分可信。普通講，同時進行紫外和電泳檢測，綜合兩者的成果，能夠做出一種更合理的判斷。但由于這兩個辦法都有缺點，因此，即使出現(xiàn)壞的成果能用于后續(xù)實驗而好的成果卻不能用于后續(xù)實驗，也不用大驚小怪。有關(guān)紫外分光光度儀的檢測。首先，不要使用不能選擇波長的儀器；使用那些已經(jīng)固定了波長的儀器，大概能夠算是你夢魘的開始

(沒有信息是可怕的，更可怕的是將錯誤的信息當(dāng)真，其中280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。)。另首先，一定要經(jīng)常調(diào)較儀器；最后，要記住讀數(shù)

A230

：A260

：A280=1：2(DNA

為

1.8)

：1

為理論上的數(shù)據(jù)，實際測定時會有某些差別；但如果差別太大，就有問題了，有兩個值得商榷的觀點：如果

A260/A230>2

就是純的，如果

A260/A280>2

就是核酸降解。A260/A230

如果比

2.0

大許多，一定是有雜質(zhì)殘留的

(具體是什么雜質(zhì)我不懂得)。如果核酸抽提好后立刻就測定，A260/A280>2.0

決不提示核酸降解，因素是：那些能造成

A260/A280>2.0

的核酸片段非常小，常規(guī)的沉淀是不可能將它們沉淀下來的；更可能的因素是：你儀器提供的

A260/A280

實際是

A262/A282

甚至

A264/A284

的值。純的核酸的吸光值，在

A230

是谷底，在

A260

是峰頂，在

A280

則正好是半山坡。根據(jù)曲線在底和頂?shù)男甭首钚。诎肷狡碌男甭首畲蟮奶攸c，不難得出以下結(jié)論：A230

和

A260

的讀數(shù)受儀器精確性的影響比較小，而

A280

受儀器精確性的影響比較大。有關(guān)電泳檢測，觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡樸辦法是運用熒光染料溴化乙錠進行染色。該物質(zhì)含有一種能夠嵌入DNA的堆積堿基之間的一種平面基團，這個基團的固定位置及其與堿基的親密靠近，造成染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加。DNA吸取254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身則在302nm和366nm有光吸取。這兩種狀況下，被吸取的能量可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。因此，當(dāng)凝膠中含有游離溴化乙錠時即能夠檢測到少量的DNA。建議先電泳檢測，再用紫外分光光度儀檢測。電泳后，能夠看到哪些樣品根本就不能用

(如降解太厲害)，以及核酸的大致濃度，這樣就為紫外分光光度儀的檢測提供了一種參考

(降解的不必要測了，要測的該取多少量等)。七、核酸中雜質(zhì)的去除對于某些對核酸純度規(guī)定較高的實驗，我們就需要對其進行特殊的解決，除去其中的多糖、蛋白質(zhì)及非目的核酸，其辦法以下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化學(xué)性質(zhì)與核酸有許多相似之處，常在提取液中殘存下來。除去的辦法常有：①取材前盡量減少組織中多糖的含量，如先使動物饑餓數(shù)天然后殺死，可使細胞內(nèi)肝糖元大大減少。②加入淀粉酶，將大分子多糖分解為小分子，在后來純化環(huán)節(jié)中逐步被除去。③在濃磷酸鹽存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下層水相，核酸在上面有機層中。④以鈣鹽沉淀DNA，再以草酸鉀解決，使之形成DNA鉀鹽回收，然后用離子交換法吸附DNA，使之與多糖分離。（2）蛋白質(zhì)的除去：由于核酸在細胞內(nèi)以核蛋白體形式存在，不管采用哪種辦法提取核酸，蛋白質(zhì)都不同程度地存在于體系中。因此，除去蛋白質(zhì)是核酸分離純化不可避免的環(huán)節(jié)。慣用辦法有下列幾個：①加入去污劑如硫酸十二脂鈉，從提取到分離純化各階段均可重復(fù)使用此法。去污劑與氯仿法或苯酚法結(jié)合使用，效果更加抱負。②氯仿-戊醇或辛醇對提取液搖蕩抽提，蛋白質(zhì)在氯仿-水界面形成凝膠，離心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分離純化中也常重復(fù)使用。③苯