DNA聚合酶連鎖反應DNA電泳分析DNA聚合酶連鎖反應目的：聚合酶連鎖反應(polymerasechainreaction,PCR)能短時間增殖、放大特定的DNA片段，而使得原先可能才只有幾個pg的DNA增加至mg，以利于其它實驗的進行。原理：變性反應(denaturation),使DNA的兩股分離。緩冷配對反應(annealing),使引子與目標DNA配對。延長反應(extension),合成新的DNA股。每一個循環操作可使DNA的量添加一倍，若重復操作多次，以數學公式計算，DNA增加的量將會是2n,n是代表重復操作的次數。在理想的聚合酵素鏈鎖反應條件下，DNA是以幾何級數增加。理論上，一個DNA分子若重復操作PCR25次，那么DNA的分子數將會擴增到33554432個分子。這個DNA的量已足夠在Agarose凝膠電泳中觀察到。試劑、器材、儀器：10xPCRbuffer成分：500mMKCl、100mMTris-HCl、pH8.8、15mMMgCl2、1%TritonX-10010|J1探TaqDN聚合酶需要有Mg2+(MgCl2)才能進行反應；但是Mg2+會和帶負電的template、primer和dNTP結合，加強雙股DNA的鍵結。所以Mg2+的濃度會影響PCR的效率和特異性，Mg2+過低PCR產物會減少，此外Mg2+解凍時會有沉淀產生。dNTP成分：dATP、dCTP、dGTD、dTTP各1.25mM16p1探dNTP會和Mg2+結合，所以過量dNTP會影響Mg2+濃度。※過多的dNTP也會增加Taq的錯誤率和抑制其活性。此外當某一種dNTP的濃度較其它三種低時也會增加錯誤率。Primers是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復制的起始點，存在于自然中生物的DNA復制(RNA引子)和聚合酶鏈鎖反應(PCR)中人工合成的引子(通常為DNA引子)。TaqDNApolymerase從熱泉中的嗜熱性細菌仃hermusaquaticus)所分離出來的耐高溫DNA合成酵素，每秒大約合成150個核甘酸。dH2O滅菌水。PCR管為了使加熱均勻且快速，所以PCR專用管都是薄壁的。使用一般微量管取代，在時間控制上會有差異。常用的PCR管有0.2mL與0.5mL兩種體積；0.2mL管各家廠商都只有作薄壁的，但0.5mL管有分一般與PCR用，使用前需注意。不過現在用0.5管的PCR儀越來越少了；新機種都是用0.2管，甚至0.1半量管或384孔盤。PCR儀器將PCR步驟自動化的儀器將試劑滴入PCR管混合均勻將PCR管制入PCR儀器設定反應條件，反應完畢即為所求DNA電泳分析目的：用電泳的方式來測量樣品DNA的純度及分子量大小，以利于其它實驗的進行。原理：DNA電泳主要是利用：1.正負電場DNA本身帶負電電泳膠內部形成各種大小不同的孔洞DNA是高度負電荷的聚分子，且負電荷是均勻分布于骨架的磷酸根上，因此不論長短，DNA的負電密度(即單位質量帶有的負電荷數目)是相同的，因此在電場中感受的引力就相同(差異不大)。所以電泳DNA并不是依分子的電荷差異而分離，而是依分子大小、構形差異而分離。一般而言，片段小的DNA因為可以穿過較小的孔隙，所以泳動速度較快，而大片段DNA只能通過大孔洞，所以速度較慢；分子的形狀也會影響電泳的速率，一般而言，速率大小為：超螺旋＞環型＞線型。此外，電泳DNA時，電壓的強度、膠體的濃度、及緩沖劑的種類都會影響移動的快慢。試劑、器材、儀器：(1)電泳用染劑功能如問題二所述(2)1%agarosegelagarosege的介質孔隙較大‘polyacrylamide的孔隙較小。所以分離大分子DNA時，會依照有否連接載體、是否切割完全、樣品中DNA大致的分子量等調配適當比例的agarose一般0.8%agaros適合區分0.5~10KbDNAo若DNAsize更大則須調降agaros的濃度比例(0.3%)若分離的DNA較小則需升高agaros的濃度(2%)。其實DNA的分離不盡然一定是agaros，e例如操作DNAsequencing時，為了更細微的比較，會使用olyacrylamide<gel(3)SybreGreen能嵌入DNA堿基中，經UV光照射能放出可見光TAE電泳緩沖溶液做為緩沖溶液DNAMARKER做為分子量的對照組電泳槽數字影像系統(8)微波爐步驟:將TAE與agarose依適當比例混合加熱。將1之混合液倒入agaros制備槽并去除氣泡、雜質。將agaroseg加入電泳槽，并加入TAE覆蓋之。將DNA與loadingbuff混合，加入agaroseg孔洞。調整適當電壓開始電泳。電泳完成后將agaroseg取出浸泡至SybreGree中30分鐘。以數字影像系統觀測，紀錄之。問題一：DNA電泳后衛何出現2條藍色，深藍色與淺藍分別由哪項化學物質所呈色？

答:深藍：答:深藍：bromophenolBlue（溴酚藍）淺藍：XylenecyanolFF（二甲苯藍）問題二:DNASample加入6