啤酒酵母多糖提取及其對雛雞免疫器官的影響

祖母的粘膜由85%.90%的碳和10%.15%的蛋白質組成，約一半的碳主要是葡萄糖和甘露醇。動物實驗證明,小鼠服用酵母多糖可增加腹腔巨噬細胞數量,提高酸性磷酸酶的活力,增強機體的細胞免疫和體液免疫,是一種極有開發價值的功能性食品營養因子。酵母葡聚糖在加強機體抗紫外線輻射、抗氧化、抗畸變、抗遺傳毒性、抗腫瘤和促進傷口愈合等方面都有顯著的作用,是一種良好的生物效應調節劑(BRMs)。此外,葡聚糖還有膳食纖維的作用,酵母甘露聚糖具有抗病毒、細菌和真菌感染、抗腫瘤、抗氧化和抗輻射、促進傷口愈合的生理活性,還可作為“生物導彈”和抗腫瘤藥物良好載體。這些應用前景使人們看好啤酒廢酵母的價值。本研究用檸檬酸法提取酵母多糖,測定多糖含量,鑒定多糖組分,提取的多糖喂食雛雞,觀察雛雞免疫器官的變化,探討酵母多糖對雛雞免疫功能的影響。1材料和方法1.1正丁醇-冰醋酸-水的計算啤酒廢酵母濟南市啤酒集團;雛雞市購。展層劑:正丁醇-冰醋酸-水=4:1:5。顯色劑:二苯胺2g、苯胺2mL、85%磷酸10mL、濃鹽酸lmL、丙酮100mL。1.2設備和設備UV-260型紫外分光光度計日本島津公司;LG10-2.4A型高速離心機北京醫用離心機廠。1.3方法1.3.1測定了母系含水量取3個潔凈干燥的燒杯,稱量。分別加適量酵母泥,稱量。放入80℃干燥箱內24h使其干燥,稱量。求3次平均值,即為酵母含水量。1.3.2從祖母綜合征中提取山羊糖的單因素試驗1.3.2.粗多糖的提取稱取4份10g濕酵母泥,用0.02mol/LpH7.2的檸檬酸緩沖液懸浮,20、30、50、70℃處理,4000r/min離心15min,冷卻至4℃,加入3倍體積的甲醇,4℃放置過夜,4000r/min離心10min,用丙酮洗滌,烘干,稱量,得粗多糖干質量,除以酵母干質量即得提取率。1.3.2.粗多糖的提取稱取4份10g濕酵母泥,用0.02mol/LpH值分別為4、6、7.2、8的檸檬酸緩沖液懸浮,30℃處理相同4h,4000r/min離心15min,冷至4℃,加入3倍體積的甲醇,4℃放置過夜,4000r/min離心10min,丙酮洗滌,然后烘干,稱量,得粗多糖干質量,除以酵母干質量即得提取率。1.3.2.粗多糖的提取稱取4份10g濕酵母泥,用pH7.2濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.05mol/L的檸檬酸緩沖液懸浮,30℃處理,4000r/min離心15min,冷至4℃,加入3倍體積的甲醇,4℃放置過夜,4000r/min離心10min,用丙酮洗滌,烘干,稱量,得粗多糖干質量,除以酵母干質量即得提取率。1.3.2.4-正交試驗選擇不同濃度的檸檬酸在不同溫度、pH值條件下進行正交設計試驗,因素水平及設計見表1。1.3.3準曲線方程用苯酚-硫酸法。繪制葡萄糖標準曲線。標準曲線方程為y=0.0046x-0.0606,R2=0.9987。多糖量除以粗多糖質量再乘以100%得酵母多糖相對含量。1.3.4多酚分析1.3.4.濾紙薄層分析20mg酵母多糖加1mol/L硫酸2mL,100℃封管水解5h,加入3.7mgBa(OH)2·8H2O中和硫酸,過濾,收集濾液行濾紙薄層分析。1.3.4.2.樣品溶液的制備葡萄糖、甘露糖各2.0g分別溶解于100mL水即為20μg/μL樣品。1.3.4.3紙層析和分析取5cm×14cm濾紙,依次點樣,點樣量20μL。然后放入層析缸內層析。當前沿離原點10cm以時停止。85℃恒溫箱顯色10min。1.3.5試驗組和對照組之間的飲酒量將同等飼養條件下發育而成的雛雞隨機等分為2組,每組8只,一組為對照組,一組則為試驗組。對照組每天每只飲自來水1.0mL,試驗組每天每只飲用1%多糖懸濁液1.0mL。于10、20日齡時,將實驗用雛雞窒息而死,解剖測量胸腺、脾臟、法氏囊的質量及盲腸扁桃體面積(盲腸基剪開,去掉內容物,鋪開測量)。2結果與分析2.1測定了母系含水量3次平均結果,酵母含水量為80.31%。2.2從祖母綜合征中提取山羊糖的單因素試驗2.2.1提取溫度對酵母多糖提取率的影響由表2可知,提取率隨著溫度的升高呈現先降低又升高的趨勢,當溫度在50℃左右時提取率達到最高,隨后溫度再升高,酵母多糖的提取率降低,因此,提取溫度50℃左右。2.2.2不同ph的提取試驗由表3可知,酵母多糖的提取率隨著pH值的升高而呈現出先升高后降低的趨勢,在pH7.2附近達到最大值,在高于pH8時,多糖的提取率又明顯低于前者,因此選擇pH7.2附近進行提取試驗。2.2.3檸檬酸緩沖液濃度對酵母多糖得率的影響由表4可知,酵母多糖的提取率隨著檸檬酸濃度的升高出現先上升后降低的趨勢,在濃度0.02mol/L附近時達到最高值,隨之再增加檸檬酸緩沖液的濃度,酵母多糖的提率反而逐漸降低,故選擇檸檬酸緩沖液濃度0.02mol/L左右為宜。2.2.4最佳提取條件b由表5可知,各因素對酵母多糖提取率的影響的主次排序為C>A>B,即pH值>檸檬酸緩沖液濃度>溫度。最佳提取條件是檸檬酸緩沖液濃度0.02mol/L、溫度40℃、pH7.2。對于優化后得到的提取工藝條件,進行驗證,計算多糖的提取率為54.4%。2.3紙層析結果結果以葡萄糖、甘露糖為標準樣,檸檬酸法提取的酵母多糖水解液為樣品,點樣20μL,通過紙層析所得結果見圖1。由圖1可見,水解產物在與葡萄糖相對應位置上顯示相同的斑點,檸檬酸法提取酵母多糖的單糖組成主要為葡萄糖。2.4多層因素對雞的免疫能力的影響2.4.1日齡上,各單側分別以“雙側”t、t/t0.05雙側為前提,20日齡時,t、t5.0.0.0.0.0.0.實行:雙側,20日齡時,t>t0.05雙側由表6可知:10日齡時,t>t0.05(雙側),即P<0.05,20日齡時,t>t0.05(雙側),即P<0.05。上述結果表明,酵母多糖對雛雞具有顯著的促生長功能。2.4.2比對照組t檢驗由表7可得,試驗組免疫器官的質量均高于對照組,胸腺、脾臟和法氏囊質量分別比對照組質量增加0.041、0.007、0.016g,分別比對照組提高25.47%、21.88%、6.25%,進行t檢驗,則t>t0.05(雙側),即P<0.05,說明差異顯著。而盲腸扁桃體面積比對照組大0.039cm,提高28.89%,t>t0.05(雙側),即P<0.05,說明酵母多糖對雛雞免疫器官的成熟有較顯著的促進作用。3酵母多糖的提取提取工藝中,檸檬酸緩沖液的pH值影響最為顯著,其次是檸檬酸緩沖液的濃度,最不顯著的影響因素是提取溫度,通過單因素和正交試驗的結果可以得出最佳提取條件是pH7.2、檸檬酸緩沖液濃度0.02mol/L、萃取溫度40℃。紙層析法表明,用檸檬酸法提取的酵母多糖主要成分為葡聚糖。胸腺和法氏囊是禽類的中樞免疫器官,脾臟和扁桃體屬于外周免疫器官。現研究發現,