crisprcas9系統(tǒng)敲除大鼠胰島素受體底物1基因

大鼠在生理、行為和代謝方面比大鼠更有利。它在研究人類正常和疾病的生理生化過(guò)程以及藥物臨床前的毒性試驗(yàn)方面發(fā)揮著重要作用。chu3'。胰島素受體底物1(Irs1)是胰島素受體酪氨酸激酶底物,是介導(dǎo)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵蛋白,與代謝病關(guān)系密切［4－5］。Irs1作為一個(gè)重要的候選基因在2型糖尿病發(fā)病機(jī)制研究方面較為深入［6］。Irs1敲除小鼠出生時(shí)體重為正常小鼠的一半,4月齡時(shí)表現(xiàn)出糖耐受損傷,并伴隨有溫和的胰島素抵抗和高胰島素血癥,是一種較好研究代謝疾病的動(dòng)物模型［5，7－9］。但小鼠生理、行為、代謝方面與人類存在較大差異,大鼠在這些方面要優(yōu)于小鼠,因此建立Irs1基因敲除大鼠,用于研究胰島素信號(hào)傳遞,胰島素抵抗以及與2型糖尿病之間的關(guān)系等,具有非常重要的意義。近幾年的研究表明,一種細(xì)菌來(lái)源的成簇規(guī)律間隔回文短重復(fù)序列以及臨近相關(guān)基因(CRISPR/Cas9),在從細(xì)菌、斑馬魚、到哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及小鼠、大鼠等都表現(xiàn)出較強(qiáng)的基因組編輯活性［10－19］。本研究將利用CRISPR/Cas9系統(tǒng),通過(guò)原核注射的方式用于產(chǎn)生Irs1基因敲除大鼠。1自身蛋白表達(dá)載體針對(duì)Irs1基因我們?cè)O(shè)計(jì)了兩個(gè)靶點(diǎn),合成兩對(duì)寡聚核苷酸鏈(Rat-IRS1-E1(1)-gRNA:TAGGGCAAAGGCCCACCATGAC和AAACGTCATGGTGGGCCTTTGC;Rat-IRS1-E1(2)-gRNA:TAGGCTGCGGTGGTAGCTGCAG和AAACCTGCAGCTACCACCGCAG)用于制備sgRNA。合成的寡聚核苷酸經(jīng)退火(95℃5min后自然降至室溫),連入經(jīng)BsaI酶切經(jīng)回收的pUC57-sgRNA表達(dá)載體(南京大學(xué)黃興許老師惠贈(zèng)),構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證連入片段是否正確,選擇正確的克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒用于準(zhǔn)備體外轉(zhuǎn)錄模板。1.2cas9mna的合成Cas9表達(dá)質(zhì)粒(AddgeneNo.44758,南京大學(xué)黃興許老師惠贈(zèng)),經(jīng)AgeI酶切線性化,經(jīng)酚氯仿抽提純化后,溶于無(wú)核酸酶的水中作為模板,用于體外轉(zhuǎn)錄。Cas9mRNA的合成由試劑盒T7UltraKit(Ambion,AM1345)在體外利用T7RNA聚合酶完成。sgRNA的表達(dá)載體經(jīng)DraI酶切線性化后,經(jīng)酚氯仿抽提純化,溶于無(wú)核酸酶的水中作為模板,用于體外轉(zhuǎn)錄。sgRNA的體外合成由試劑盒MEGAshortscriptKit(Ambion,AM1354)在體外利用T7RNA聚合酶完成。1.3假孕受體大鼠的制備轉(zhuǎn)錄好的Cas9mRNA和sgRNA混合并調(diào)整濃度至20ng/μL和10ng/μL/每種sgRNA,顯微注射法將RNA混合物注射到SD大鼠的受精卵的雄性核和細(xì)胞質(zhì)中(大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(京)2012-0001】),用SD大鼠作為假孕受體大鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(京)2012-0001】),制備轉(zhuǎn)基因大鼠(TE2000U纖維注射儀)。實(shí)驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物在本所衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室繁育(【SCXK(京)2013-002】),實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物操作程序已經(jīng)得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物使用與管理委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào)為ILAS-GC-2012-001。1.4pcr和t7核酸內(nèi)切酶檢測(cè)大鼠在出生7~14d時(shí),用剪腳趾標(biāo)記法標(biāo)記,收集剪下的組織,選用經(jīng)典的酚氯仿方法提取基因組DNA,溶于0.1×TE中。設(shè)計(jì)一對(duì)引物包含sgRNA作用靶點(diǎn),上游引物為R-IRS1-S1:5’-CTCACCCAGTTTTTCGACACC-3’,下游引物為R-IRS1-AS1:5’-AGAAGTTCTCTGAGTGGCCACA-3’(上海英俊生物技術(shù)有限公司合成,中國(guó))。PCR反應(yīng)體系50μL(PCR反應(yīng)相關(guān)試劑購(gòu)自寶生物工程有限公司,中國(guó))。反應(yīng)條件:95℃5min;(95℃30s,60℃30s,72℃30s)×30;72℃10min;保存4℃。擴(kuò)增片段大小為687bp。用PCR純化試劑盒(Takara公司)純化PCR產(chǎn)物。取100ng純化后的PCR產(chǎn)物在NEBBuffer2中變性、復(fù)性后,用T7核酸內(nèi)切酶(NEB,M0302L)37℃孵育40min,然后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離。T7核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別不完全配對(duì)的雙鏈DNA,并進(jìn)行切割,如果CRISPR/Cas9對(duì)靶點(diǎn)造成了突變,將能夠被該酶識(shí)別,并造成雙鏈DNA斷裂。因此,在瓊脂糖凝膠電泳中存在除PCR產(chǎn)物帶之外的條帶,說(shuō)明退火產(chǎn)物能夠被T7核酸內(nèi)切酶識(shí)別并切割,表明靶點(diǎn)DNA序列可能存在突變。為進(jìn)一步驗(yàn)證突變存在,以及突變情況,我們將通過(guò)TA克隆、測(cè)序進(jìn)一步檢測(cè)確定突變。1.5逆轉(zhuǎn)錄rt-irs1-f-gaggactrt-3-開(kāi)發(fā)sact基因頸椎脫臼法犧牲大鼠,提取F1代雜合大鼠和野生(WT)對(duì)照大鼠的肝臟、骨骼肌、脂肪、腎臟和脊髓總RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(LifeTechnologies)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用引物RT-IRS1-F:5’-GGAGGACTTGAGCTATGACACG-3’和RT-IRS1-F:5’-GAGGATTGTTGAGATGGTGCCT-3’擴(kuò)增目的基因,大小為437bp擴(kuò)增目的基因。GAPDH作為內(nèi)參,確定Irs1在兩種組織中的表達(dá)情況,比較雜合子和野生對(duì)照大鼠的Irs1表達(dá)差異。2結(jié)果2.1cas9在rna-pcr中的作用靶點(diǎn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種相對(duì)于ZFNs和TALENs更為簡(jiǎn)單的基因組編輯技術(shù),近幾年來(lái)引起了廣泛的興趣。Cas9包含有一個(gè)HNH基序和三個(gè)RuvC基序,分別同源于HNH和RuvC內(nèi)切核酸酶［20－22］(圖1A)。研究表明Cas9能夠在單一的導(dǎo)向性RNA(sgRNA)的作用下,識(shí)別含有PAM(Pro-spaceadjacentmotif,NGG基序)靶序列,并實(shí)現(xiàn)把DNA序列的雙鏈斷裂(圖1B)。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的sgRNA的作用靶點(diǎn)設(shè)計(jì)方法［10，21，23］,設(shè)計(jì)作用靶點(diǎn)。本文中,我們針對(duì)Irs1基因設(shè)計(jì)了兩個(gè)sgRNA作用靶點(diǎn)。依據(jù)sgRNA載體經(jīng)BsaI形成的粘性末端,合成寡聚核苷酸鏈,經(jīng)退火后連入pUC57-sgRNA載體中(圖1C),完成sgRNA載體構(gòu)建,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。2.2靶點(diǎn)dna的pcr和基因型鑒定Cas9表達(dá)質(zhì)粒和sgRNA表達(dá)載體,分別經(jīng)AgeI和DraI線性化后,經(jīng)酚氯仿抽提后,作為模板利用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄合成Cas9mRNA和sgRNA。隨后按Cas9mRNA(20ng/μL)和sgRNA(10ng/μL)混合后,通過(guò)原核注射法顯微注射SD大鼠的受精卵。我們通過(guò)顯微注射并移植了65個(gè)受精卵到2個(gè)假孕大鼠中,后來(lái)一只孕鼠意外死亡,最后共產(chǎn)生6只大鼠。我們對(duì)靶點(diǎn)DNA的PCR擴(kuò)增,從圖2A中明顯看出這六只大鼠中有5只與野生型條帶相比存在明顯差異。隨后我們靶點(diǎn)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)T7EN1實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步靶點(diǎn)基因突變情況(圖2B),結(jié)合PCR擴(kuò)增結(jié)果,只有#5鼠未有明顯變化,說(shuō)明CRISPR/Cas9在#5鼠中未發(fā)揮作用或發(fā)揮作用后經(jīng)過(guò)了正確的修復(fù),為便于統(tǒng)計(jì),我們認(rèn)為其未發(fā)生任何基因修飾改變。隨后我們對(duì)其余5只可能存在基因修飾的大鼠靶點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物,通過(guò)TA克隆、測(cè)序最終確定了CRISPR/Cas9對(duì)Irs1造成的基因修飾情況(圖3),結(jié)果顯示效率可達(dá)83%。前面的結(jié)果可以看出#2大鼠含有94bp的缺失基因型,該缺失造成了Irs1基因的移碼突變,并提前產(chǎn)生了終止密碼子,為進(jìn)一步驗(yàn)證該技術(shù)造成的缺失是否可以穩(wěn)定傳代。我們將#2大鼠與野生型的SD大鼠進(jìn)行交配,產(chǎn)生了11只子代大鼠。我們對(duì)F1代產(chǎn)生的大鼠,進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和基因型鑒定,結(jié)果表明該缺失能夠穩(wěn)定遺傳(圖4)。通過(guò)本項(xiàng)目的研究,我們利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)大鼠Irs1基因進(jìn)行了敲除。3基因敲除動(dòng)物的基因組織設(shè)計(jì)基因敲除技術(shù)作為一種重要基因工程手段在研究基因功能方面發(fā)揮著重要作用。基于胚胎干(ES)細(xì)胞基因打靶技術(shù)為精確的遺傳學(xué)修飾提供了一種強(qiáng)有力的手段。在過(guò)去的20多年里,該技術(shù)在建立基因敲除、基因敲入和條件性基因敲除小鼠模型發(fā)揮了極為重要的作用［24］。但由于大鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)條件的限制,直到2010年才建立了第一種基于ES細(xì)胞的基因敲除大鼠模型(p53基因敲除大鼠模型)［25］。但目前,基于大鼠ES細(xì)胞上水平的遺傳學(xué)修飾不僅時(shí)間周期非常長(zhǎng),要經(jīng)歷ES細(xì)胞水平打靶、克隆篩選、囊胚注射形成嵌合體,到產(chǎn)生雜合的遺傳修飾大鼠模型需要一年半到兩年的時(shí)間,而且ES細(xì)胞的培養(yǎng)條件并不非常成熟,對(duì)環(huán)境人員要求都非常苛刻。這些因素嚴(yán)重限制了基因工程大鼠模型的制備。大鼠比小鼠在研究生理、代謝和藥物篩選方面具有更多的優(yōu)勢(shì),近幾年來(lái)隨著技術(shù)的發(fā)展,使得大鼠作為一種重要的動(dòng)物模型開(kāi)始回歸實(shí)驗(yàn)室。Irs1是胰島素受體酪氨酸激酶底物,在胰島素刺激引起信號(hào)轉(zhuǎn)到中起重要作用,與代謝病關(guān)系密切。本研究利用近年發(fā)展起來(lái)的基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)大鼠的Irs1基因進(jìn)行敲除,建立Irs1基因敲除大鼠,效率達(dá)83%。本研究為研究胰島素信號(hào)傳遞,胰島素抵抗以及與2型糖尿病之間的關(guān)系提供Irs1基因敲除大鼠。近十幾年的研究,表明基因組編輯技術(shù)如基因組編輯技術(shù)如鋅指核酶(ZFNs)技術(shù)［26－27］、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子(TALENs)技術(shù)［28－30］和CRISPR/Cas系統(tǒng)［31－34］,在從細(xì)菌到高等哺乳動(dòng)物都表現(xiàn)出較高的基因組編輯活性。在應(yīng)用于建立基因敲除小鼠和大鼠模型方面發(fā)揮著極為重要的作用。ZFNs和TALENs需要針對(duì)每個(gè)設(shè)計(jì)的作用靶點(diǎn),設(shè)計(jì)構(gòu)建兩個(gè)特異性的質(zhì)粒表達(dá)特異性蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)目的基因的靶向性敲除,設(shè)計(jì)和操作相對(duì)比較繁瑣,不適用于大部分實(shí)驗(yàn)室。CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌一套免疫系統(tǒng),依據(jù)主要的核心組成元件和序列CRISPR/Cas系統(tǒng)組要分為I,II,III型［34］,其中II型來(lái)源的Cas9蛋白,表現(xiàn)出非常強(qiáng)的DNA裂解活性。這種核酸酶活性僅僅需要一種非編碼RNA-小導(dǎo)向性RNA(sgRNA)介導(dǎo)下即可實(shí)現(xiàn)定向基因打靶［10］,因此CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用較為廣泛。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種相對(duì)于ZFNs和TALENs更為簡(jiǎn)便、快速的基因組編輯技術(shù),在應(yīng)用于基因敲除動(dòng)物模型