雜交水稻兩優培九抽穗及開花過程中的線粒體結構變化

水稻強和虛弱粒的播種量和豐滿度差異很大，達到25%左右。弱勢粒約占水稻籽粒的1/3左右(大穗型品種),且隨著穗形的增加,弱勢粒所占的比例更大。由于弱勢粒結實率和充實度較低,極大地限制了水稻高產潛力的發揮。因此,不少學者從植物激素及與籽粒灌漿有關的酶等方面對強、弱勢粒進行了一些生理生化特性的研究[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11]。揭示了強、弱勢粒的結實率和充實度差異的一些生理原因。然而關于強、弱勢粒核酸代謝差異的研究尚未見報道,系統進行強、弱勢粒胚乳細胞形成及上部一次枝梗和下部二次枝梗維管束結構和生理特性與強、弱勢粒的結實率和充實度關系的研究較少。植物體內的功能物質——蛋白質是由脫氧核糖核酸(DNA)轉錄成核糖核酸(RNA),然后再由RNA翻譯而成的。RNA在植物體內不能長期存在,發揮功能后很快被RNA酶降解,RNA含量特別是mRNA含量反映了基因轉錄活性的高低。因而強、弱勢粒RNA含量特別是mRNA含量反映了籽粒(庫)活性大小。上部一次枝梗與下部二次枝梗分別是水稻強勢粒和弱勢粒著生的地方,是營養物質進入籽粒的通道,其維管束發育的好壞直接影響無機物和有機物向籽粒的運輸,胚乳細胞的數目和大小反映了籽粒發育的狀況。所以探討強、弱勢粒RNA特別是mRNA含量以及上部一次枝梗與下部二次枝梗維管束的結構和生理差異以及強、弱勢粒胚乳細胞形成的差異,對于了解強勢粒和弱勢粒結實率和充實度的差異具有重要意義。1材料和方法1.1各取材粒的剝削對花穗的剝削和保存水稻(Oryzasativa)品種兩優培九(培矮64S/9311)。于單穗抽穗當天、第5天、第7天和第12天各取整齊一致的200穗,分別剝取強勢粒(上部3個一次枝梗上抽穗當天開花的籽粒,第7天和第12天因其灌漿較多,子房破裂而不取)和弱勢粒(下部3個二次枝梗上除去頂粒,抽穗后7d開花的籽粒)的子房,立即投入液氮,置-70℃冰箱保存。1.2neasymini洗脫按Qiagen公司的RNeasyPlantMiniKit的說明書進行。先取100mg樣品放入液氮中研磨成勻漿,后加入450μL的胍基硫氫酸緩沖液,并渦旋振蕩,使核酸酶變性失活,以得到完整的核酸。把樣品液移入QIAshredder旋轉柱中,在20℃下18000×g離心2min,上清液中加入225μL的乙醇,提供硅膠膜束縛核酸的條件,把樣品加入到含有硅膠膜的RNeasymini旋轉柱中,總RNA吸附到硅膠膜上,用緩沖液洗脫各種污染物。最后用無核糖核酸酶的水把總RNA從RNeasymini旋轉柱中洗脫下來。用DU-640核酸蛋白分析儀測定其含量和純度。1.3poli-a與ol空間雜交按Qiagen公司OligtexTMKit說明書進行。在250μL的總RNA樣品中加入250μL的OBB緩沖液和15μL的Oligotex懸浮液并混合均勻,在70℃水浴中溫育3min,室溫下放10min,使mRNA的Poly-A與Oligotex粒子雜交,然后在20℃下以18000×g離心2min,以沉淀oligotex-mRNA復合物。用400μL的OW2緩沖溶液重新懸浮oligotex-mRNA并轉移到一個小旋轉柱中,在20℃下以18000×g離心1min,重復此步驟1次。最后加OEB緩沖液于小旋轉柱中,在20℃下以18000×g離心1min,把mRNA從oligotex-mRNA中洗脫下來。1.4弱勢粒和弱勢粒房或胚乳于抽穗當天、抽穗后3d及強、弱勢粒乳熟期,從整齊一致的穗上分別剝取強勢粒和弱勢粒子房或胚乳;于抽穗當天、抽穗后15d,從整齊一致的穗上取上部一次枝梗和下部二次枝梗,制成石蠟切片,于Olympus顯微鏡上觀察攝影,記錄胚乳細胞的數目,用目鏡測微尺測量維管束導管和韌皮部的面積。1.5水浴加熱處理取0.5g樣品粉末,置50mL三角瓶中,加40mL的蒸餾水,80℃水浴中處理30min,過濾至50mL容量瓶中,定容。吸取提取液1mL放入10mL潔凈試管,加蒽酮試劑5mL,混勻,冷卻,用721型分光光度計在625nm波長下測定其含量。1.6蛋白質提取液的制備準確稱取水稻強弱勢粒子房0.5g,放入研缽,加2mL0.1mol/LNaOH,研磨成勻漿,轉入10mL離心管,再用6mL0.1mol/LNaOH分3次洗滌研缽,洗液一并轉入10mL離心管,用玻棒攪拌,放置30min,其間攪拌數次,3500r/min離心15min,上清液轉入50mL容量瓶,用蒸餾水定容至刻度,搖勻,得蛋白質提取液。吸取提取液0.1mL,放入10mL具塞刻度玻璃試管,加5mL考馬斯亮藍G-250試劑,混勻,放置2min,用10mm光徑的比色杯在595nm波長下用DU-640核酸蛋白分析儀比色,記錄OD值,根據標準曲線計算出蛋白質的含量。2結果與分析2.1形態不良反應發生情況從表1可知,提取的總RNA、mRNA純度都達1.9以上,達到了兩者的純度要求。水稻抽穗當天,強勢粒中總RNA、mRNA含量都高于弱勢粒,抽穗后第5天,強勢粒中總RNA含量仍然高于弱勢粒,mRNA含量兩者差異不大,開花當天(強勢粒抽穗當天,弱勢粒抽穗后第7天)和開花后第5天(強勢粒抽穗后第5天,弱勢粒抽穗后第12天),強勢粒中總RNA、mRNA含量和單粒含量都高于弱勢粒。強勢粒抽穗后0~5d(即開花后0~5d)總RNA、mRNA含量變化不大。弱勢粒抽穗后0~5d,總RNA含量顯著上升,mRNA含量變化不大。5~7d,總RNA,mRNA含量進一步增加。7~12d(即開花后0~5d),總RNA、mRNA含量都有所下降。不論是強勢粒還是弱勢粒,從抽穗、開花到開花后5d,其總RNA、mRNA和單粒含量都有顯著的增加。2.2抽穗和湖乳的發育進程和結構觀察水稻的胚乳細胞是其灌漿物質的儲藏單位,籽粒的灌漿生長以胚乳細胞的增殖和充實為基礎,胚乳細胞的發育狀況對稻米品質和產量有決定性的影響。強、弱勢粒胚乳細胞的結構如圖1。實驗表明,水稻的強、弱勢粒胚乳細胞的發育進程和結構有較大的差異。抽穗當天,強勢粒已經開花受精,子房開始膨大,而弱勢粒尚未開花受精,子房尚未膨大,抽穗后第3天,強勢粒子房進一步膨大,胚囊中已形成較多的胚乳細胞,而弱勢粒仍未開花受精,子房仍未膨大(圖略)。抽穗后20d,強勢粒已經乳熟,而弱勢粒尚處于灌漿期,抽穗30d后才達到乳熟,取乳熟的強勢粒和弱勢粒,剝取胚乳,分中部、腹部和背部制成石蠟切片,并顯微攝影,觀察到無論是中部、腹部或背部,強勢粒胚乳細胞較多,體積較小,細胞壁較厚,而弱勢胚乳細胞較大,細胞壁較薄,數目較少。強勢粒中部一個縱剖面胚乳細胞數平均為245,弱勢粒為186,強勢粒比弱勢粒要多32%,而單個細胞剖面面積要小32%(如圖1)。2.3兩優培九上、下二次枝梗維管束結構水稻籽粒的充實有賴于源(主要為葉片)的供應能力和庫(籽粒)吸收光合產物的能力以及它們的橋梁——流(維管束系統)的通暢程度,三者缺一不可。現測得雜交水稻兩優培九枝梗微管束特征如表2。從表2可知,上部一次枝梗大維管束數目與下部二次枝梗大維管束數目相等,均為1,但導管面積和韌皮部面積均為上部一次枝梗大維管束大于下部二次枝梗大維管束;而小維管束數目和小維管束韌皮部面積則上部一次枝梗小于下部二次枝梗,小維管束導管面積則上部一次枝梗大于下部二次枝梗。上部一次枝梗大小維管束導管面積之和和韌皮部面積之和都大于下部二次枝梗。由于本實驗所取枝梗為上部一次枝梗頂端負擔2個籽粒和下部二次枝梗負擔2個籽粒的部分,它們所負擔的籽粒數相等,可見上部一次枝梗維管束與下部二次枝梗維管束相比具有量的優勢。當然,僅有量的優勢是不夠的,還必須具有質的優勢才能真正有利于無機物和有機物的運輸。雜交水稻兩優培九上部一次枝梗和下部二次枝梗維管束結構如圖2。從圖2可知,上部一次枝梗維管束導管、篩管和伴胞都很清晰,單個導管、篩管和伴胞面積較大,而下部二次枝梗維管束導管、篩管和伴胞則較模糊,單個導管、篩管和伴胞面積較小。可見,上部一次枝梗維管束、導管、篩管都比下部二次枝梗發育得好,分化程度高,具有質的優勢。2.4可溶性糖含量變化可溶性糖是枝梗維管束運輸的主要物質,蛋白質是細胞的功能物質。兩者的含量反映了枝梗細胞的物質代謝狀態(表3)。從表3可知,上部一次枝梗可溶性糖含量抽穗當天較低,0~10d迅速上升,10~20d有所下降,20~40d又逐漸上升;下部二次枝梗可溶性糖含量抽穗當天很低,0~10d有所上升,10~20d迅速上升,20~30d有所下降,30~40d明顯上升。灌漿初期上部一次枝梗可溶性糖含量高于下部二次枝梗,成熟期低于下部二次枝梗。分析表明,枝梗可溶性糖含量與籽粒灌漿動態及維管束活性有密切關系,抽穗當天,由于強勢粒尚未灌漿,流經上部一次枝梗維管束的可溶性糖較少,故含量較低。抽穗后10d,由于強勢粒迅速灌漿,流經上部一次枝梗維管束的可溶性糖很多,故含量很高,10~30d強勢粒灌漿減少,流經上部一次枝梗維管束的可溶性糖減少,此時雖有少量的糖滯留其中,但與灌漿初期上部一次枝梗維管束內運輸的大量的可溶性糖相比,其含量降低。30~40d少量的可溶性糖在源端壓力的驅動下,經上部一次枝梗繼續向強勢粒運輸,然而,此時強勢粒吸引可溶性糖的活力較低,上部一次枝梗對可溶性糖運輸的阻力成為強勢粒灌漿的限制因子,可溶性糖便在上部一次枝梗中積累起來。所以其可溶性糖含量上升。下部二次枝梗可溶性糖含量也存在類似的情況,0~20d隨著弱勢粒灌漿強度的增加,其含量逐漸上升,20~30d有所下降,30~40d弱勢粒吸引可溶性糖的活力較低,可溶性糖便在下部二次枝梗中積累起來,所以其可溶性糖含量上升。由于下部二次枝梗維管束發育不良,對有機物運輸的阻力更大,所以可溶性糖含量更高。說明成熟期可溶性糖含量反映了上部一次枝梗和下部二次枝梗維管束對有機物的運輸能力。從表3還可知,上部一次枝梗與下部二次枝梗從抽穗期到成熟期蛋白質含量都呈下降趨勢,各時期上部一次枝梗蛋白質含量都低于下部二次枝梗。上部一次枝梗維管束發育較好,導管和韌皮部面積較大,薄壁細胞面積較小。導管是特化的死細胞,僅存細胞壁,無細胞質,蛋白質含量自然很低,為非質體,有利于水和礦物質的運輸。韌皮部主要由篩管組成,篩管細胞無細胞核,僅存部分細胞質,蛋白質含量可能也較低,有利于有機物的運輸。而薄壁細胞為活的細胞,代謝較旺盛,蛋白質含量較高。由于上部一次枝梗導管和篩管面積較大,且發育較好,薄壁細胞總面積較小,所以各時期蛋白質含量都低于下部二次枝梗。說明蛋白質含量高,意味著維管束發育不良,不利于無機物和有機物的運輸。3形態變異的原因從本研究可知,水稻強弱勢粒核酸代謝存在著差異。抽穗當天,強勢粒總RNA、mRNA含量都高于弱勢粒,說明強勢粒抽穗后,與籽粒灌漿有關的基因優先大量轉錄,翻譯出與籽粒灌漿有關的蛋白質(酶),所以強勢粒庫活性高,灌漿較早,結實率和充實度較高;而弱勢粒則相反,抽穗后,由于沒有立即啟動與籽粒灌漿有關的基因轉錄,不能產生相應的功能蛋白質(酶),所以弱勢粒庫活性升高較晚,灌漿較遲,結實率和充實度較低。強勢粒之所以能優先啟動與灌漿有關的基因表達,與其開花受精較早有關,強勢粒抽穗當天即開花受精,由于受精作用,啟動了新的基因轉錄,而弱勢粒開花受精作用要晚7d左右,其啟動與灌漿作用有關的基因表達較遲,此時,水稻群體相對衰弱,源的供應不足。這種基因表達的時序差異導致籽粒灌漿期的營養差異是強弱勢粒結實率和充實度差異的重要原因。開花當天和開花后第5天,強勢粒中總RNA、mRNA含量和單粒含量都顯著高于弱勢粒,說明強勢粒開花受精后基因表達的強度高,能產生較多與籽粒灌漿有關的功能蛋白質,所以庫(籽粒)活性高,吸引營養物質的能力強。這種基因表達的強度差異是導致強、弱勢粒結實率和充實度差異的又一原因。張祖建等研究表明,弱勢粒的充實主要受制于胚乳細胞數目。楊建昌等研究表明,在品種(組合)內,胚乳重和籽粒充實度與胚乳細胞數呈極顯著的正相關,與單個胚乳細胞重相關不顯著。推測弱勢粒胚乳細胞少,發育不良,灌漿初期生理活性低是其結實率和充實度低的重要原因。本研究表明,強勢粒比弱勢粒受精早7d左右,其胚胎發育進程也較早,最終胚乳細胞數也較多,然而細胞體積較小,細胞間隙也較小,籽粒灌漿的物理障礙較小,故結實率和充實度較高。從本研究可知,兩優培九上部一次枝梗維管束與下部二次枝梗維管束相比發育較好,導管、篩管和伴胞都分化程度高,導管面積和韌皮部面積以及單個導管、篩管和伴胞都較大,而下部二次枝梗維管束導管、篩管和伴胞則較模糊,單個導管、篩管和伴胞都較小。特別是伴胞對物質的運輸可能起著的重要作用,它和篩管都起源于單個形成層細胞,與篩管關系密切,有許多分枝的胞間連絲相連,具有相對稠密的細胞質和細胞核,液泡較小,線粒體、高爾基體和內質網豐富,能以ATP的形式向篩管提供能量,這些能量在推動有機物在韌皮部運輸中起重要作用。另外,伴胞還能把葉肉細胞產生的同化產物傳遞到篩管。因而伴胞可能在有機物韌皮部裝載和運輸中起重要作用。有些伴胞具有許多內生生長的細胞壁,大大增加了細胞膜的表面積,促進同化物從葉肉細胞轉移到篩管。上部一次枝梗維管束與下部二次枝梗維管束相比由于具有較多發育良好的導管、篩管和伴胞,所以強勢粒結實率和充實度都較高。從本研