第第頁單胺氧化酶（MonoamineOxidase，MAO）試劑盒說明書單胺氧化酶（MonoamineOxidase，MAO）試劑盒說明書微量法100T/96S注意：正式測定之前選擇23個預期差異大的樣本做推測定。測定意義：MAO（EC1.4.3.4）重要存在于脊椎動物的各種器官，特別是分泌腺、腦、肝臟，在無脊椎動物、豆類的芽等植物中也存在催化單胺類物質代謝，含量較低，具有緊要的生理功能，其活性能反映肝纖維化的程度。另外，MAO活性異常導致細胞內單胺類神經遞質運轉顯現紊亂，從而引發多種病癥。測定原理：MAO催化單胺類底物脫氨生成相應的醛，進一步氧化成酸；底物在360nm處有特征汲取峰，測定360nm光汲取下降的速率，計算MAO活性。自備試驗用品及儀器：天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。試劑構成和配制：提取液一：液體100mL×1瓶，4℃保管。提取液二：液體100mL×1瓶，4℃保管。試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保管。試劑二：液體2mL×1管，4℃避光保管。粗酶液提取：1.稱取約0.1g樣品，加1mL預冷的提取液一充足冰浴勻漿，1000g，4℃，離心10min，棄沉淀；把上清轉移到另一預冷的離心管，10000g，4℃，離心30min，棄上清；加入1mL預冷的提取液二，震蕩混勻，16000g，4℃，離心40min，棄上清；沉淀加入預冷的1mL試劑一，震蕩混勻，即粗酶液（可用于可溶性蛋白濃度測定）。2.細菌、真菌：依照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波碎裂細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，棄沉淀；把上清轉移到另一預冷的離心管，10000g，4℃，離心30min，棄上清；加入1.0mL預冷的提取液二，震蕩混勻，16000g，4℃，離心40min，棄上清；沉淀加入預冷的1.0mL試劑一，震蕩混勻，即粗酶液（可用于可溶性蛋白濃度測定），取上清置于冰上待測。3.血清：直接測定。測定操作表：1、分光光度計/酶標儀預熱30min，調整波長至360nm。2、操作表對比管測定管酶液（L）20試劑一（L）180160試劑二（L）2020混勻，于微量石英比色皿/96孔板，對比管調零，測定360nm處吸光值A1，然后37℃水浴60min，對比管調零，測定360nm處吸光值A2、ΔA=A1A2注意：空白管只需測定一次。MAO活性計算公式：a．用微量石英比色皿測定的計算公式如下1、按蛋白含量計算酶活定義：37℃，pH7.6時，每毫克蛋白質1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。DAO活性（nmol/min/mgprot）=×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=114×ΔA÷Cpr2、按樣本質量計算：酶活定義：37℃，pH7.6時，每克樣品1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。DAO活性（nmol/min/g鮮重）=×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T=114×ΔA÷W3、依照細胞數量計算酶活定義：37℃，pH7.6時，每104個細胞1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。DAO活性（nmol/min/104cell）=×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數量）÷T=114×ΔA÷細胞數量4、依照液體體積計算酶活定義：37℃，pH7.6時，每升血清1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。DAO活性（nmol/min/L）=×V反總÷V樣=114×ΔAε：底物摩爾消光系數，1460L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應總體積，0.2mL；V樣：反應中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應時間，60min，W：樣本質量，gb．用96孔板測定的計算公式如下1、按蛋白含量計算酶活定義：37℃，pH7.6時，每毫克蛋白質1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。DAO活性（nmol/min/mgprot）=×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=228×ΔA÷Cpr2、按樣本質量計算：酶活定義：37℃，pH7.6時，每克樣品1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。DAO活性（nmol/min/g鮮重）=×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T=228×ΔA÷W3、依照細胞數量計算酶活定義：37℃，pH7.6時，每104個細胞1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。DAO活性（nmol/min/104cell）=×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數量）÷T=228×ΔA÷細胞數量4、依照液體體積計算酶活定義：37℃，pH7.6時，每升血清1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。DAO活性（nmol/min/L）=×V反總÷V樣=228000×ΔAε：底物摩爾消光系數，1460L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應總體積，0.2mL；V樣：反應中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cp