奶牛流產布氏桿菌的分離鑒定

布氏桿菌病是一種在世界上流行的人類疾病。世界動物衛生組織(OIE)將其列為B類動物疫病,我國將其列為二類動物疫病。自1895年Marston等首次報道布氏桿菌病以來,已經確定的布氏桿菌有6個種屬20個生物型,牛布氏菌病是引起牛流產的主要病因之一,以流產布氏桿菌(Brucellaabortus)感染最常見,以母畜發生流產和不孕,隨子宮排泄物和乳汁排出病原菌,公畜發生睪丸炎和不育為主要患病特征。2005年1～5月,黑龍江省大慶市2個牛場(DC1和DC2)、五常市1個牛場(DC3)和伊春市1個牛場的奶牛頻繁發生流產。為弄清病因,對4個牛場進行了流行病學調查,同時采集病料,通過病原分離鑒定、血清學診斷和PCR鑒定確定引起奶牛流產的主要病原菌,為牛場布氏桿菌病的預防和控制提供依據。1材料和方法1材料表面1.1疾病宣言1.2培養基和試劑2方法2.1培養基細胞培養將流產胎牛真胃內容物,肝臟和脾臟等病料分別接種于10%的新鮮綿羊血營養瓊脂培養基,分別做普通需氧、微需氧和厭氧(燭缸法)培養,37℃培養3～5d后觀察菌落形態和有無溶血情況,并進行革蘭染色、沙黃孔雀綠和改良Ziehl-Neelsen染色鑒定。2.3細菌的生化特性2.4菌株和引物布氏桿菌IS711(插入序列)在數量和位置上都很保守,所有的種在單染色體上都含有至少1個拷貝的IS711。根據布氏桿菌不同種IS711的不同設計4條引物,分別用于鑒別流產布氏桿菌、豬布氏桿菌(B.suis)和羊布氏桿菌(B.ovis)。引物由上海生物工程技術有限公司合成。P1:5/-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3′;P2:5/-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3′;P3:5/-GCGCGGTTTTCTGAAGGTTCAGG-3′;P4:5/-CGGGTTCTGGCACCATCGTCG-3′。P1和P2用于鑒定流產布氏桿菌,擴增產物為498bp;P1和P3用于鑒定豬布氏桿菌,擴增產物為285bp;P1和P4用于鑒定羊布氏桿菌,擴增產物為976bp。2.4.2pcr和凝膠電泳采用25μl反應體系:引物濃度均為0.5μmol/L,dNTP濃度200μmol/L,LATaqDNA聚合酶1.25U,PCR緩沖溶液(100mmol/LTris-HCl,pH8.3,50mmol/LKCl,0.1%BSA,20mmol/LMgCl2),DNA模版1μl,補充去離子水至總體積為25μl。反應參數:94℃預變性10min;94℃變性50s,61.1℃退火1min,72℃延伸50s,共30個循環;72℃延伸10min。取8μlPCR產物,用1%的瓊脂糖凝膠在0.15×TBE電泳液(0.045mol/LTris-硼酸,0.001mol/LEDTA,pH8.0)中電泳,EB染色,利用凝膠成像系統(GelDoc2000)觀察擴增結果。4個牛場送檢75份流產奶牛血清。采用國標GB/T18646-2002動物布氏桿菌病診斷技術檢測布氏桿菌抗體。同時采用衣原體間接血凝試驗(IHA)檢測上述血清,按試劑盒使用說明操作。送檢血清中DC110份,DC215份,DC320份,DC430份。結果1年生反壓h4個牛場奶牛流產發生情況見表1。奶牛流產發生率為9.5%(102/1100),流產發生在妊娠期1～4周、5～7周和8周至產前者分別占9.8%(10/102)、68.6%(70/102)和21.6%(22/102)。2病牛有蓮子內皮炎病牛流產前數天開始從陰門流出淡黃色惡臭液體;流產后多數病牛有子宮內膜炎,人工授精比較困難;胎衣不下,呈淡黃色膠凍樣浸潤,可見纖維蛋白絮狀物和膿性分泌物。3胎盤牛檢查流產胎牛多數皮下膠胨樣水腫,腹腔積液,肝臟腫大,脾臟稍腫大且質軟,腎臟膠胨樣水腫。未發現畸胎。4細菌的分離和鑒定4.1培養基細菌生長和生物量病料接種培養基,需氧條件下培養3d未見細菌生長,培養1周觀察仍未見細菌生長。厭氧培養和微需氧培養至第4d,接種真胃內容物的血液營養瓊脂培養基均有細菌生長,菌落中等大小,圓形隆起,表面光滑、濕潤,有光澤,無色透明,側光觀察呈輕微乳色和略帶藍灰色,不溶血,不易溶于生理鹽水。2份流產胎牛的肝臟和脾臟材料經上述方法培養有相同細菌生長。4.2紅色菌體的檢測取菌落涂片,革蘭染色和改良Ziehl-Neelsen染色后菌體均呈紅色;沙黃孔雀綠染色呈藍色或綠色,細菌呈球桿狀或小桿狀,多單個散在,無芽孢和莢膜。4.3生物化學試驗的結果分離的生化試驗結果見表2。根據《伯杰細菌鑒定手冊》確定各分離株生化指標符合布氏桿菌的主要特征。5擴增pcr擴增分離到的6株細菌用P1和P2引物作PCR,均擴增出約498bp的片段,P1與P3和P1與P4兩對引物均未擴增出目的片段(圖1)。6株布氏桿菌均為流產布氏桿菌。6凝集試驗結果4個牛場送檢血樣104份,布氏桿菌試管凝集試驗陽性85份,陽性率81.7%,另有11份為疑似陽性(表3)。衣原體IHA檢測75份血樣,結果均為陰性。黨牛和外在血藥病人的感染和傳氏桿菌病根據流行病學調查、臨床癥狀、病理剖檢情況及微生物學和血清學診斷,確診4個牛場奶牛流產主要由布氏桿菌引起。通過PCR方法擴增布氏桿菌插入子序列IS711,進一步鑒定分離出的6株布氏桿菌均為流產布氏桿菌。布氏桿菌是需氧菌,在有氧條件下生長良好,但是流產布氏桿菌1～4型多數必須有CO2的條件才能生長。本次實驗中分離到的流產布氏桿菌只能在5%O2、10%CO2和85%N2的微需氧環境中生長,在有氧條件下1周未見其生長,符合該菌的培養特性。通過流行病學調查及臨床癥狀分析發現,感染布氏桿菌奶牛容易在妊娠后5～8個月間發生流產,剖檢流產胎牛普遍表現皮下水腫特別是臍帶水腫,腹腔和膝關節腔積液,肝臟腫大,腎臟膠凍樣水腫,但未見胎?；?可供臨床診斷。引起奶牛流產的原因比較復雜,傳染和非傳染性因素都可能引起流產。傳染性原因包括細菌、霉菌、病毒和原蟲感染,其幾率分別為50%～65%、20%～25%和15%～25%。奶牛細菌性流產的病原以布氏桿菌較多見。朱戰波等在暴發奶牛流產的牛場,從流產胎牛體內分離到流產胎兒彎曲菌,可見由胎兒彎曲桿菌引起的牛流產也不容忽視。非傳染性的因素包括營養狀況,化學物質、藥物、毒素、有毒植物和激素等。各地的氣候、飼養管理條件等情況不同,流產的發生率也不同。本次試驗中,104頭流產牛血清衣原體IHA陰性,也未檢測到彎曲菌,說明本地區可能不存在牛衣原體病,布氏桿菌病是造成本地奶牛流產的主要病因。布氏桿菌有高度的侵襲力和擴散力,可以通過正常的皮膚、黏膜侵入機體,也可通過呼吸道、消化道和生殖道傳染。目前對布氏桿菌病仍無有效的治療藥物,主要以預防為主。由于該病臨床上多呈隱性經過,又缺乏典型癥狀,極易被忽視。因此奶牛場要堅持每年進行兩次布氏菌病血清學檢測,對平板凝集試驗陽性和可疑者要進一步進行試管凝集試驗和補體結合試驗,確診的病牛必須及時予以淘汰,同群健康牛進行免疫接種,防止布氏桿菌病流行。流產母牛血清,流產胎牛的第四胃內容物,肝、脾和羊水等(無菌采集)。10%血液瓊脂培養基,按常規方法制備。生化管購自杭州天和微生物有限公司(批號:20041220);LATaqDNA聚合酶、dNTP和Marker購自寶生物工程(大連)有限公司。布氏桿菌試管凝集抗原、陽性血清和陰性血清,購自黑龍江省生物制品一廠(批號:20050103);衣原體試劑盒購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所(批號:20040512)。對4個牛