第二十一章常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication第一節(jié)

分子雜交與印跡技術(shù)

MolecularHybridization&BlottingTechnology核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)

。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理（一）印跡技術(shù)（二）探針技術(shù)

探針(probe)一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。

二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡技術(shù)

(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。（二）RNA印跡技術(shù)

(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析

(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。

PaperTowelsSouthernBlottissueSDSProtKPhenolChloroformethanolprecipitationSpinSouthernanalysisRNA印漬技術(shù)主要用于檢測某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平以及比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。NorthernBlot放射自顯影照片目錄WesternblotWesternBlot三種印跡技術(shù)的比較

其他斑點(diǎn)印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點(diǎn)陣(DNAarray)DNA芯片技術(shù)(DNAchip)原位雜交原位雜交技術(shù)可分析基因在染色體上的位置原位雜交（insituhybridization,ISH）是利用分子雜交技術(shù)對基因在染色體上定位的一種技術(shù)。基本程序是細(xì)胞或組織固定→預(yù)雜交→雜交→沖洗→放射自顯影或標(biāo)記酶顯色→分析結(jié)果。原位雜交的特點(diǎn)是雜交在顯微鏡載玻片上中期染色體標(biāo)本上進(jìn)行。熒光原位雜交（FISH）是一種非放射性原位雜交方法，用特殊熒光素標(biāo)記核酸（DNA）探針；已有多重原位雜交，分辨率可達(dá)100～200kb.原位雜交時(shí)使用熒光探針發(fā)現(xiàn)染色體上的一個(gè)基因③分子雜交實(shí)驗(yàn)①②目錄限制性內(nèi)切酶譜分析法

限制性內(nèi)切酶

特異性DNA探針

待測序列中發(fā)生突變時(shí)會導(dǎo)致某些限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶譜的改變（如特異性片段的大小和多少改變），使得電泳遷移率改變×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正常基因5′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析RLFP分析法中性突變：人基因組中，平均每200對堿基可發(fā)生一次突變，這種突變對生物體的生存既沒有好處，也沒有害處。DNA多態(tài)性：中性突變導(dǎo)致個(gè)體間核苷酸序列的差異。限制性片段長度多態(tài)性:由于多態(tài)性發(fā)生限制性酶切位點(diǎn)上，導(dǎo)致導(dǎo)致酶切可產(chǎn)生長度不同的片段。第二節(jié)

聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction1983.4KaryMullis在開車前去北加利福尼亞紅樹縣Redwoodcountry的一條被月光籠罩的山路上構(gòu)思了PCR隨后賣給了Roche公司價(jià)格：10.000$

1993Nobelprize

模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

二、PCR體系基本組成成分三、PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C（一）目的基因的克隆（二）基因的體外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）參與基因突變分析的檢測四、PCR的主要用途PCR誘變在引物中引入非配對堿基，通過PCR引物可以在擴(kuò)增產(chǎn)物中引入點(diǎn)突變，目的基因1目的基因2內(nèi)參actin1234采用PCR技術(shù)也可以分析基因拷貝數(shù)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（二）原位PCR技術(shù)（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)RT-PCR分析基因轉(zhuǎn)錄水平的變化

逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR，RT－PCR）又稱RNA－PCR。

逆轉(zhuǎn)錄PCRReversetranscriptase-PCRAAA(A)n5‘-CapmRNA(dT)12~18

primeranneal5‘-CapAAA(A)n3‘5‘ReversetranscriptasedNTP5‘-CapAAA(A)n5‘cDNA:mRNAhybridRegu