RNA干擾技術董瑩董翠玲陳崇波

12006年諾貝爾生理學或醫學獎：美國斯坦福大學AndrewZ．Fire美國馬薩諸塞大學CraigC．Mello，以表彰他們發現了RNAi現象2什么是RNAi？一、RNAi的發現二、RNAi的分子機制三、RNAi的生物學功能與意義四、RNAi試驗方法3一、RNAi的發現4WTPlantwithapigmenttransgenePostTranscriptionalGeneSilencinginPetuniaRNAi的發現51995年，GuoS等試圖阻斷秀麗線蟲（C.elegans）中的par-1基因的表達設計：反義RNA特異性地阻斷par-1基因的表達正義RNA以期觀察到基因表達的增強結果:二者都同樣地切斷了par-1基因的表達途徑。這是與傳統上對反義RNA技術的解釋不相符合。該研究小組一直沒能給這個意外以合理解釋6直到1998年2月，FireA和MelloC才首次揭開這個懸疑之謎。他們將體外轉錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時發現，基因抑制效應變得十分微弱；而經過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應基因的表達。他們證實，GuoS博士遇到的正義RNA抑制基因表達的現象，以及過去的反義RNA技術對基因表達的阻斷，都是由于體外轉錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。該小組將這一現象稱為RNA干擾（簡稱RNAi）。7RNAi概念

RNA干擾(RNAi)是指dsRNA在細胞內特異性地誘導與之同源互補的mRNA的降解，使相應基因的表達關閉，從而引發基因轉錄后水平沉默的現象。8RNAi

特點轉錄后水平的基因沉默機制較高的特異性抑制基因表達具有較高的效率有濃度、時間雙重依賴性基因表達的效應可以突破細胞界限9二、RNAi的分子機制1.起始階段(theinitiationphase)2.效應階段(thesubsequenteffectorphase)10dsRNA通過外源導入、轉基因或者病毒感染等方式進入細胞后，專一性的雙鏈RNA內切酶Dicer識別dsRNA，在ATP的參與下逐步把dsRNA切割成長約21～23nt的片段。Dicer11siRNA參與形成RNA誘導的沉默復合物(RISC)，ATP激活的RISC在雙鏈siRNA的反義鏈指導下，尋找與siRNA具有同源序列的內源靶mRNA，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割靶mRNA，導致轉錄后基因沉默。1213三、RNAi的生物學功能與意義14RNAi的生物學功能抵抗病毒入侵抑制轉座子活動，保護基因組的完整性調控基因表達清除畸變的RNA參與基因組重排15RNAi的生物學意義1.研究功能基因組學的新工具2.研究信號傳導通路的新途徑3.研究發育過程中起作用的基因4.開展基因治療的新策略16四、RNAi試驗方法171.篩選RNAi探針2.制備siRNA

化學合成、體外轉錄、用RNaseⅢ消化長片斷雙鏈RNA、siRNA表達載體、siRNA表達框架3.導入細胞

電穿孔法、磷酸鈣共沉淀、DEAE一葡聚糖、陽離子脂質體試劑4.RNAi轉染效率熒光蛋白(如GFP)或熒光素酶等報告基因與其共表達法1819Abstract：Invitro,RNAiisanalmost-standardmethodtoknockdownanytargetgene.Invivo,itseffcientdeliveryandspecificitytothetargetgenechallengeitstherapeuticapplication.Now,manyeffortshavemadetoenhancesiRNAdeliveryandtargetorganspecificity.20InvitroseveraltransfectionreagentsallowthedeliveryofsiRNAsinmammaliancellsinthepresenceorabsenceofserumIn

vivorequirethedevelopmentofmoresophisticatedformulationsand/ortheidentificationofoptimalmodesofadministration21TherapeuticsiRNAmolecules

Cancer:Targetmoleculesusuallyrepresentgenesthathavebeenshownpreviouslytoberelevantorrate-limitingfortumorgrowthAntiviraltreatment

:novelRNAi-basedapproachestobattleviralinfectionsrelyonthespecificsiRNA-mediatedknockdownofvirus-specificgenes22ThisstudiesprovidevaluableinsightsintothedeliveryandefficacyoffortheinductionofRNAi.23Clinicaltrials

ALN-RSV01:targetthehumanRSVafterviralinfection,whichisthefirstexampleofanantivirussiRNA-basedtherapeuticinaphaseⅠclinicalstudy.

Sirna-027:TotreatAMD,

after24-monthphaseIIstudy,IthasalreadyusedforrecruitingpatientswithAMD.Cand5:whichisnownamedBevasiranib,wasthefirstsiRNAtoenterbothphaseIandIIclinicaltrials.24StrategiesforinvivosiRNAdelivery

TheadvantagesofthedirectapplicationofsiRNAs:thelowerprobabilityonspecificsideeffectsthesafetyofsiRNAdeliveryisbasedonnonviraltransferstrategiessiRNAscannotintegrateintothegenome25

SuccessfulsiRNAbasedgenetargetingreliesonseveralpreconditions:

ProtecttheinstablesiRNAmoleculesEfficientcellularuptakeandintracellularreleaseintothecytoplasmTheabsenceofintracellularimmuneresponses26TheformulationofsiRNAsincarriersystems：LiposomalformulationsNanoparticlespolyethylenimine(PEI)ItcanbeconsideredasexamplesofnonviralenvelopesthatprotectsiRNAs,thusincreasingserumstability,reducingrenalexcretionandmediatingsiRNAuptakeintothecellsthroughendocytosisnanoparticleswithpositivelychargedmacromolecules.Basedonelectrostaticinteractions,complexesareformedwithatelocollagenchitosanorPEIPEI/siRNAcomplexesaregoodforenhancingtissuespecificityandinvivobiocompatibility,reducingimmunogenicityandtoxicityandincreasingsiRNAdelivery2728ConclusionandoutlookAveryefficientandspecificmethodfortheknockdownThesuccessofsiRNAswilldependo