電壓敏感染料成像vsdi技術的研究進展

研究神經元的群體活動從第一感覺處理和運動協調到高級意識和思維活動，我們需要與數千萬個計算的神經元相結合，并創建一個功能網絡。這張網絡錯綜復雜,只監視其中單一或少數神經元的活動很難解釋腦的功能,就像只看電視機屏幕上的少數像素不能理解劇情一樣。所以,研究神經元的群體活動對了解腦的功能有重要意義。統觀各種神經電生理研究方法:微電極和膜片鉗等方法多被用來在微觀尺度上記錄少數幾個神經元的電信號,腦電圖、腦磁圖和功能核磁共振等技術常被用在宏觀尺度上記錄大規模的腦活動。而在這兩類方法之間的介觀尺度(mesoscopicscale,即時間尺度為1～100ms、空間尺度為10～10000μm的量級)上,應用電壓敏感染料和光學成像(voltagesensitivedyeandopticalimaging,VSDI)技術,可以獲得很好的時空分辨率,使得我們可以在神經元群體、皮層功能柱等層次上,研究腦的信息處理、記憶形成、功能可塑性及病理過程等,以進一步解釋腦的功能。pubmed對傳統電壓敏感染料成像技術的應用從上世紀40年代起,Hill和Keynes已開始利用光學方法對神經元的電活動進行實驗記錄。當時探測到的光學信號主要是由光在神經組織里的散射引起的,稱作“內源性光信號”,其缺點是信號微弱且遠慢于神經電活動。Tasaki等最早將一種電壓敏感染料(voltagesensitivedye,VSD)應用于烏賊巨軸突的電生理研究中,以增加光學信號的強度。這種用染料幫助產生的光信號相應地被稱作“外源性光信號”。染料分子吸附在神經細胞膜的外表面,而細胞脂膜的厚度只有3nm左右,當神經細胞興奮而產生動作電位時,雖然電壓只有0.1V左右,相應的電場強度卻可以達到3×107V/m,足以影響吸附在細胞膜上的染料分子的結構,或影響分子周圍的微環境,使得染料分子對光的吸收光譜或熒光光譜產生變化。實驗表明,染料分子對光的吸收譜或熒光譜的變化與膜電位的變化在很大范圍內是線性的關系,并且能達到微秒級的響應速度,因此,電壓敏感染料信號可以忠實地記錄單個動作電位(圖1)。從上世紀70年代起,Cohen研究組(圖2)就系統地開展了電壓敏感染料光成像技術的研究。他們篩選了近千種化合物以找到一種實用的染料,該染料既可以與神經元細胞膜穩定結合,又能比較方便地透過神經細胞的外圍組織染到細胞。這些從早期工作中找到的染料直到今天仍在使用。在Cohen小組的影響下,尋找染料的工作由最先的發展電壓敏感染料成像技術延伸到發展鈣離子敏感染料成像技術,由發展神經活動的光記錄延伸到其他熒光探測分子的成像技術。這些技術到今天都已經形成了獨立的大領域,對生命科學的貢獻也遠遠超過了電壓敏感染料成像技術,而電壓敏感染料成像技術卻始終是一個很小的研究領域。到目前為止,在PubMed中搜索到的應用電壓敏感染料成像技術進行神經科學研究的相關論文只有2000篇左右。在世界范圍內,近十年來使用此技術發表5篇以上論文的小組也只有約20個(表1)。限制這個領域發展的主要原因有兩個:一是其光信號太弱,由膜電位變化引起的染料信號變化只有靜息時背景光強的萬分之一到百分之一;二是選擇性差,化學染料對神經細胞或膠質細胞沒有選擇,對神經細胞中的興奮或抑制細胞也沒有選擇。相比之下,鈣敏感染料的信號是靜息光強的0.1倍甚至幾倍。而近年來高速發展的“光學遺傳學”(optogenetics)方法可以將病毒攜帶的鈣敏感染料的基因,精確地在一類特異的興奮或抑制細胞上選擇性表達;還可以攜帶光敏離子通道,達到同時用光學方法選擇性地刺激和記錄不同種類神經細胞的目的。看起來,傳統的電壓敏感染料似乎已經大大地落后了。但是鈣敏感染料的時間分辨率很低,只能達到百毫秒數量級,比一般神經電活動都要慢。因此,要研究神經活動的動態過程,傳統電壓敏感染料目前仍是最有效的工具。比如,在大腦皮層上出現的螺旋波每秒要轉十圈左右,因此要求染料的時間分辨率至少要達到毫秒數量級。由于篇幅所限,本文只介紹“快信號”電壓敏感染料技術及其在神經元群體活動(populationactivity)方面的應用實例。抗光催化機實驗VSD的信號小并不是指光強度低,而是指信號只是背景光上的一個小變化,其相對幅度只有10-5～10-2;另外,信號變化很快,像神經動作電位只有不到2ms,皮層上的群體活動也只能持續幾十毫秒。這種又小又快的信號不可能被眼睛看到,也不可能被普通CCD和CMOS照相機記錄到。為了記錄VSD信號,Cohen小組在1970年左右發展了一種技術,讓成像裝置的每個像素擁有自己獨立的兩級放大器,這樣就能忽略背景光的直流成分而只放大其變化,可以有效地記錄10-5的小信號。最初的“成像”裝置只有十幾個像素(圖3A),后來把光敏二級管做成二維陣列,達到124和464像素(圖3B、C)。因為每個光敏二級管都要有一根輸出線,整個裝置需要幾百個高靈敏度的放大器,因此要達到更高的空間分辨率就比較困難了。現代CCD相機雖有幾百萬像素,比這種裝置的空間分辨率高幾萬倍,但所有像素只能通過一個或少數幾個通道輸出,整個系統只有一個到少數幾個放大器,因此其信噪比遠不如光電二極管陣列。圖4所示為這種設計的一種商用裝置,其型號為WuTech-469V。這個系統使用469個單個光電二級管,并用一束光導纖維把成像平面上的光信號低損耗地饋給每個二極管,這樣就避免了集成電路二極管陣列低效率、低可靠性和極高設計價格的缺陷。此裝置還同時把464個放大器緊湊地裝在同一個小盒子里,使之能穩定工作,互不干擾。這個系統是目前使用VSD成像技術研究神經元群體活動的一種實用工具,已經在全球60多個實驗室中應用。值得一提的是,雖然在理論上可以通過增加更多的像素來進一步提高空間分辨率,但實際上是沒有必要的,因為信號噪聲比是由光子的數量決定的,增加空間分辨率會減少到達每個像素上光子的數目,并不能提高成像的質量。圖5A所示為進行整體動物實驗時所采用的VSDI實驗裝置。成像裝置采用熒光顯微鏡,將短波長激發光投射到大腦皮層表面,把染料產生的熒光收集并投射到二極管陣列上。這個裝置使用特殊的鏡頭,犧牲了一定的空間分辨率來換取百倍高的光通量。因為二極管陣列只有幾百個像素,對鏡頭的空間分辨率要求不高,而提高光通量則更為重要。圖5B和C顯示皮層上的VSD信號來源。染料RH1691是Grinvald小組在上世紀90年代合成的,其激發光為紅黃色(630nm),熒光為深紅色(>690nm),這樣的熒光光譜可以避開血紅蛋白的吸收峰,大大地減少了由于腦組織中血液循環造成的光干擾。從染色組織的截面上看,通過皮層表面的染料主要集中在新皮層的Ⅱ、Ⅲ層,這里是VSD信號的主要來源。圖6所示為VSD信號與皮層上腦電記錄的比較。當麻醉比較深的時候(1.5%isoflurane),腦電呈間歇簇狀放電形式,VSD信號也可以記錄到相應的簇狀放電信號。在同一個動物的同一個記錄點上,當麻醉水平降低的時候(1.1%isoflurane),腦電呈睡眠狀波動(2～5Hz),而VSD信號也記錄到相應的波動。這說明VSD信號雖小,但靈敏度可以與腦電記錄相當。從光和電信號的比較來看,二者的波形略有不同,原因是腦電信號與局部電流有關,一個比較強的電流源,即使在遠處也會被腦電電極記錄到;而VSD信號來自細胞膜上的染料,只記錄本地膜電位的變化而不受遠處強信號源的干擾。由于這種區別,VSDI可以在幾毫米直徑的成像野內觀測幾百個點的電位變化,其空間分辨率遠遠高于多導腦電記錄。從理論上講,用雙光子成像方法可以進一步提高空間分辨率。因為用雙光子方法只會在鏡頭焦點附近的染料處產生熒光,這樣就可以大大減少非焦點處組織的散射光,以提高成像質量。但在實踐中,用雙光子顯微鏡記錄VSD信號,目前還沒有實際應用,這主要是因為:雙光子成像需要兩個光子幾乎同時打到一個染料分子上,才能使之發出熒光,這樣,其亮度就遠遠低于普通的熒光顯微鏡。由光子流不均勻產生的噪音叫做“散粒噪聲”(shotnoise)或肖特基噪聲,散粒噪聲與亮度的平方根成正比,而同時,光信號的幅度與亮度成正比。這樣,VSD方法的信噪比就與亮度的平方根成正比。目前最好的電壓敏感染料的信號大約是靜息光亮度的10%左右,但是,神經動作電位只有1ms時程,在這么短的時間內,雙光子散粒噪聲往往達到30%左右,使信號淹沒在噪聲中。與此相比,鈣敏感染料的信號也在10%左右,但因為其信號的時程在100ms左右,在同樣的光強下,散粒噪聲只有3%。因此,雙光子成像可以很容易地記錄到鈣離子染料的信號。由此可知,要想用雙光子方法記錄到VSD信號,必須用極強的激光以增加亮度,減少噪聲。使用vsdi視覺皮質運動的運動及其朝向選擇性的調節視覺是感覺的重要組成部分之一。在視野不同位置的光刺激,會興奮皮層不同位置的神經元,這種皮層對視覺刺激的空間組織分布稱作皮層上的視網膜拓撲圖(retinotopicmap)。由于VSDI可獲得視覺皮層神經電活動的空間信息,因此,采用VSDI技術能得到許多用單細胞電生理方法看不到的結果。Grinvald等應用VSDI對猴初級視覺皮層(V1)成像的研究表明,除了在V1的Ⅳ層有與視野場相關的空間分布對應關系外,在Ⅱ/Ⅲ層里還有功能柱間水平方向的擴散。Palagina等進一步發現,當視網膜損傷后,損傷投射區(lesionprojectionzone)的神經元會被起源自未受影響皮層區域的活動的傳播所激活,證明皮層的水平連接可以彌補由于損傷所致的垂直投射的功能缺失。這些結果說明,V1內的不同皮層功能柱之間的水平連接,可能在視覺信息處理方面有重要的意義。另一個經典的實驗是關于線運動錯覺(linemotionillusion)的研究。線運動錯覺是早期格式塔理論的一個例子,即人在感知一個突然變成長條的小方塊時,會認為這個小方塊是慢慢變長的,而不是一下子變長的。Jancke等應用VSDI技術研究了這種情況下視覺皮層電活動的時空模式(圖7),結果與人所感知到的情形相似。這給早期心理學的格式塔式認知理論提供了證據,支持了自上到下的視覺加工模式。之后,Rangan等通過計算機模擬的研究表明,該現象與皮層間遠距離NMDA能神經元的間歇性去抑制有較大關系。但是,Markounikau等借助VSD信號建立的神經場模型說明,形成這樣的時空模式也許并不需要更高級皮層的反饋信息。再有,便是對V1朝向選擇性的進一步闡釋。以前的研究顯示,朝向選擇性有丘腦前饋輸入固有選擇性和皮質內在環路的調節作用兩種可能機制。Sharon等應用VSDI技術,通過對貓V1染色發現,持續的視覺皮層活動(即前饋機制)并不影響朝向選擇性的調節,而皮質內在環路機制會更強地抑制與偏好方向垂直的神經元興奮。后續的研究又進一步表明,朝向選擇性和空間選擇性是由駐波和行波兩個不同環路引起的,朝向選擇性由駐波參與,而空間選擇性由行波參與。聲音的方位steft聲音的音調定位是聽覺系統一個很重要的功能。早期的實驗證明,不同頻率的聲音在初級聽覺皮層(A1)的定位不同,也形成類似視網膜拓撲圖的音調拓撲圖(tonotopicmap)。對天竺鼠使用純音刺激,并用VSDI進行記錄,可知低頻率聲音可以激活A1的喙部,而更高頻率的聲音可以激活A1的尾部,這與之前觀察到的音調拓撲圖一致;同時,在聽覺皮層內也觀察到了與視覺皮層類似的、在Ⅱ/Ⅲ層水平方向傳播的神經興奮活動。人主要通過雙耳效應(binauraleffect)辨別聲音的方位。如果聲源不在人的正前方,而是偏向一邊,那么聲源到達兩耳的距離就不相等,聲音到達兩耳的時間與相位就有差異,即雙耳時間差(interauraltimedifference,ITD)。如果頭部側向聲源,到達兩耳的聲壓級會有不同,人會把這種細微的差異與原來存儲于大腦的聽覺經驗進行比較,并迅速作出反應,從而辨別出聲音的方位。近期的體內VSDI研究結果表明,不同長短的ITD會激活A1的不同區域。即使在同一個ITD的情況下,激活的區域也會隨著時間的推移有很大的變化,但是不同ITD的情況下,激活的區域是不會重疊的。這項研究證實了ITD也有自己特定的胡蘿卜干桶狀皮質的x射線防護由于嚙齒類動物的胡須實驗很容易操作,而且相對應的初級軀體感覺皮層(S1)的胡須桶狀皮層(whiskerbarrelcortex)是功能柱理論的典型代表,所以軀體感覺皮層的研究主要集中在嚙齒類動物的胡須桶狀皮層上。實際上,一根胡須的感覺并不只興奮一個桶狀的區域。Fezerou等在小鼠皮層內進行的VSDI研究表明,刺激一根胡須產生的神經電活動會擴散到整個桶狀皮層,甚至進一步傳播到運動皮層。Sato等進一步證明,通過刺激S1的Ⅳ層,可以觀察到興奮傳遞至Ⅱ/Ⅲ層,不僅在Ⅱ/Ⅲ層進行水平方向的擴布,并且還會深入傳播到Ⅴ/Ⅵ層,引起島葉皮層的興奮。胡須桶狀皮層也常常被用來研究神經的可塑性。Wallace等通過剝奪大鼠一側A、B、C三組胡須、保留D、E兩組胡須,來觀察剝奪后胡須桶狀皮層的神經元電活動的模式分布。通過VSDI成像發現,興奮在對側E組桶狀區域有明顯加強,而同側的D、E區域并沒有明顯變化。這表明,對側皮層在胡須桶狀皮層拓撲圖的形成過程中可能有著比同側更為重要的意義。VSDI在軀體感覺皮層的損傷修復性研究方面也有應用。Brown等通過中風,損傷成年小鼠一側S1中主管前肢的FL(frontlimb)區,然后使用VSDI觀察神經電活動,以探索FL區是如何重塑恢復的。實驗表明,新恢復的區域占據了一部分與損傷同側的初級軀體運動區域(M1)和主管后肢的軀體感覺區域HL(hindlimb),并向周圍有更遠的分布以代償FL區的損傷。嗅球內的復雜神經動力學模式與其他感覺皮層不同,嗅覺皮層錯綜復雜,含有大量嗅小球結構。一直以來,人們嘗試尋找不同的嗅覺刺激與嗅球內神經元興奮的對應關系。早期,Freeman等的研究發現了兔子分辨氣味時嗅球內的復雜神經動力學模式,但變化并不顯著。后來,Cohen小組也陸續做了關于嗅覺的研究。他們發現,吸入一種氣味可以在嗅球產生三處振蕩(圖8)。之后,該小組進一步對這個現象進行了實驗,發現如果再吸入一種氣味,之前產生的兩處振蕩會受到抑制,而新吸入的氣味如果與第一個相同的話,第三處振蕩會加強,如果不同則會減弱。然而,通過這些復雜的現象,至今仍無法推論出一個明晰的動力學結果,用以預測氣味引發嗅球的活動。vsdi成像技術VSDI在大腦皮層中皮層擴散性抑制(corticalspreadingdepression,CSD)的研究中也有相應的應用。CSD是由神經元和神經膠質細胞去極化引起的一種慢波,傳播速度只有3mm/min,并且具有“全或無”的特點。其形象好比從被刺激點引發,然后向周圍擴散成新月形,在皮層、小腦、基底神經節、丘腦、海馬等處均可見到。在早期的實驗里,通常使用玻璃電極測定直流電勢的方法來檢測CSD,而且只能得到一維的鋒電位信號。使用VSDI技術對大鼠皮層擴散性抑制進行成像,可以通過檢測一條與波面平行的弧線,來獲得與早期實驗相應位點上類似的結果,并有直觀的多點時空模式,而且,所得的結果在閾下復極化時更加準確。但更為重要的是,VSDI成像技術可以提供CSD十分直觀的二維成像模式,可反映波是如何行進的,并且有著很高的時空分辨率。CSD在人腦的多種病理狀態下存在,包括已有明確證據的蛛網膜下腔出血、惡性中風和頭部外傷等。另已有文獻證明,CSD在傳播速度上與偏頭痛先兆(migrainevisualaura,MVA)完全匹配,表明CSD可能是偏頭痛先兆的根本機制,進一步應用VSDI研究,也許可以獲得數據更加精確的電生理記錄結果。基于vsdi的癲癇模型癲癇是腦部神經元群陣發性異常放電所致的發作性的運動、感覺、意識、精神、植物神經的功能異常,是一種由多種原因引起的疾病。顳葉癲癇是各種癲癇綜合征中最常見的類型,可嚴重影響患者正常的生活、工作和學習,是中樞神經系統疾病中的一大頑癥。VSDI技術可以對顳葉癲癇發病機制的研究提供便利。普遍認為海馬的結構在顳葉癲癇發作的產生中有著較為重要的作用,然而,在癲癇發作與海馬神經可塑性兩者之間的相關性方面仍有爭議。近期,Ang等使用VSDI對大鼠海馬結構電信號的傳遞進行了研究,發現由齒狀回介導調節的、將信號傳入海馬的通路,在患有癲癇的動物海馬切片中并沒有變化,本該相對受到抑制的、從皮層直接傳入到CA1區的TA通路(temporoammonicpathway)卻被大大加強,認為可能與顳葉癲癇發作相關。之后又有研究證明,這個被大大加強的區域位于臨近CA2的CA1區。這些工作為進一步研究藥物針對性治療顳葉癲癇提供了基礎。應用傳統腦電圖記錄到的癲癇特征電活動,是一些不同于背景電活動的腦波或復合波,如棘波、棘(尖)慢復合波等,且常以爆發形式出現。馬洪濤等應用VSDI對活體大鼠皮層內癲癇樣發放進行了研究,發現間期發放和發作狀發放有相同的起源過程和傳播速度,但這兩種發放的起源點的分布不同,間期發放的起源點呈分散分布,而發作狀發放的起源點呈簇狀分布,間期發放和發作狀發放的起源點之間沒有明顯的時空聯系。這一結果為進一步理解癲癇的發作機制做了鋪墊。難治性癲癇常常使用手術的方法來治療,但癲癇病灶的定位卻并非易事。丁山等利用青霉素皮層注射,使白兔產生癲癇灶,再用VSD對病灶進行染色,以準確判斷病灶的范圍,進而可以全切病灶。實驗組癲癇癥狀和癲癇腦波的研究結果顯示,利用這種方法進行的手術,治愈率遠高于對照組。隨著對染料毒性的不斷明確,如果可以輔以良好的外科成像設備,VSDI在癲癇手術方面也會有一定的應用前景。免疫抑制劑的作用抑郁癥是神經癥的一種,以情感低落、思維遲緩,以及言語和動作減少和遲緩為典型癥狀。引起抑郁癥的因素包括:遺傳因素、體質因素、中樞神經介質的功能及代謝異常,以及精神因素等。在神經機制方面,目前的學說主要包括單胺能神經遞質學說(即多巴胺、去甲腎上腺素、5-羥色胺等遞質在突觸信號傳遞中下調或者不平衡會導致抑郁癥的發生)、應激學說和神經生發學說等。根據應激學說,下丘腦釋放的促腎上腺皮質素釋放激素(corticotropinreleasinghormone,CRH)可以通過下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸(hypothalamo-pituitary-adrenalaxis,HPAA)產生過量皮質醇,可能對單胺類受體有抑制作用。但是,CRH是如何具體作用于中樞系統的,尚無定論。vonWolff等使用VSDI技術,針對CRH對小鼠海馬切片的影響進行了研究。通過對海馬切片使用CRH,可以明顯看到DG區向CA1區的傳播增強,而缺少促腎上腺皮質素釋放激素受體1的海馬切片則沒有此現象。這證實了CRH不僅可以通過應激通路導致抑郁癥,而且對海馬的直接作用也有可能是誘發疾病的機制之一。神經生發學說認為海馬區域的神經元損失會導致抑郁。Airan等使用VSDI對熒光強度進行定量測量,證實抑郁癥模型大鼠的海馬DG區受到抑制而CA1區的興奮性增強;使用抗抑郁藥物Fluoxetine,可以使DG區新生神經元增多并且提高興奮性,而CA1病理性通路得到抑制,從通路層次說明DG區新生神經元對抑郁癥有抑制作用。這個實驗也進一步通過動物的行為表觀闡明了神經生理環路的內在表型與情感行為的直接相關性,這對情緒的研究也有所助益。種機制所產生的學習機制應用VSDI成像方法對大腦皮層的觀測,使經典神經生理學中的一些觀點發生了改變。經典生理學認為,感覺信號與其引起的皮層興奮,它們之間存在一種點對點的拓撲關系:比如老鼠的每一根胡須在感覺皮層上對應一個專有的功能柱;在視覺空間上每一個光點都會引起初級視覺皮層上點對點的特定功能柱的興奮。而應用VSD成像的觀測卻看到不同的現象:感覺輸入在皮層中不但引起點對點的興奮,而且還引起了一個廣泛擴布的興奮波(propagatingwaves)。興奮波擴布的范圍常常涵蓋整個感覺區域,遠遠大于經典生理學定義的感覺拓撲投射區(sensoryrepresentationsite)。這個結果說明,感覺信號進入皮層后不僅激活了專用的功能柱和特定的線路,還激活了大量非特異的神經細胞。雖然這種非特異的激活只對每個神經元產生很小的去極化,但由于受影響的神經細胞數量很大,可能會產生很大的整體效果。大腦無論在清醒、睡眠、感知,還是產生運動的過程中,無時不刻地產生興奮波,100多年前發明腦電技術時,已經能夠探測到這些興奮波的信號。但是,由于興奮波的傳播速度很快(約100mm/s),只有VSD成像技術可以對這些興奮波的時空狀態進行描述。神經興奮波的產生原理是比較復雜的,至少有四種可能的機制類型:延遲型、接力型、振蕩型和自組織型,如圖9所示。所謂延遲型,是指網絡中所有單元接受同一個波源的驅動,由于從波源到每個單元的延遲時間不同,從而形成空間相位分布(圖9A)。接力型是指當前興奮的神經細胞通過興奮性突觸激活周圍處于靜息狀態的神經細胞,使后者在下一時刻產生興奮(圖9B)。由于網絡中的神經細胞依次產生興奮,在空間中形成相位分布。接力波的擴布方式很像森林火災中的火浪,由當前正在燃燒的樹木引燃周圍的樹木,使之在下一時刻燃燒。一個神經接力波有波前和波尾。波前的神經網絡從未被波興奮過,而波尾的神經細胞則在前一時刻剛剛被波興奮過。由于波前處于靜息狀態的網絡更容易被興奮,波尾已被興奮過的網絡處于不應期內而不容易被興奮,因此,接力波的傳播矢量總是從波的中心指向興奮性更高的波前。振蕩型神經興奮波有點象運動場(團體操)中的人浪,在人浪中,每一個人都做站起蹲下的動作,而每個人的動作又會根據周圍人的動作進行調整,這樣整體耦合起來,就形成了一個宏觀的波浪(圖9C)。在神經網絡中,每一個神經細胞都是一個小振蕩器,在靜息、興奮和不應期三種狀態中循環。在這三種狀態中,在靜息狀態接受到興奮性輸入會使振蕩的相位提前,而在不應期內接收到興奮性輸入則會使振蕩的相位滯后。這種波產生的空間相位是由單元之間的耦合決定的。自組織型波是由大量興奮性元件耦合而涌現(emergent)出的復雜的整體行為。圖9D給出了兩個簡單的自組織型波的例子。左邊的例子是一個環形回路,興奮波在回路上周而復始地循環,產生振蕩和空間相位分布;右邊是在皮層上實際觀察到的螺旋波,螺旋波可以在二維平面網絡中產生振蕩和空間相位分布。在這兩個例子中,整個網絡中雖然沒有一個單元是振蕩器,卻能通過自組織特性涌現出振蕩及空間相位分布。在實際的皮層神經網絡中,上述四種機制可能同時出現并產生興奮波。比如,很多興奮型或振蕩型單元會受到同一波源的驅動,產生延遲型、接力型和振蕩型的混合波,而這些混合波的空間分布又會導致自組織型波的出現。興奮波把大量神經細胞的活動整合起來,因此會涌現出極為復雜的整體行為,也許這恰恰是意識和思維這類復雜過程的物質基礎。關于興奮波的一個首要問題是:這些波究竟本身就有功能,還是大腦活動的副產品(就象空調工作時的嗡嗡聲)?這個問題是自發現腦電以來就有的一個老問題,VSD成像作為一種新技術對認識這個老問題提供了一些新的證據。下面舉例說明VSD成像技術對回答這個老問題的新貢獻。前面提到,皮層中的興奮波可以使大量神經細胞得到非特異的去極化。一個興奮波的波前會使神經細胞去極化而提高興奮性,而在興奮波尾的不應期內,則會使網絡興奮性降低。因此,如果興奮波的傳播矢量(方向與速度之積)是可以被調整的,網絡中何時何地出現非特異的興奮或抑制就可以被控制,進而參與信息處理過程。興奮波的速度大約在100mm/s左右,必須用VSDI這種高速成像技術才能捕捉其動態變化。2007年,徐偉鋒等利用VSDI技術,首先發現與視覺有關的興奮波的波速可以被神經網絡控制。如圖10A所示,由視覺刺激引起的興奮波在V1-V2邊界的速度急劇減慢,出現一種“壓縮”現象。他們接著證明,只有視覺刺激引起的興奮波才會出現壓縮。而皮層中自發產生的興奮波,雖然非常頻繁地通過V1-V2邊界,卻完全沒有壓縮現象。興奮波的壓縮有功能嗎?徐偉鋒等的結果提示,壓縮以及后來的反射,可以使V1和V2兩個區域的興奮性同時提高。第二個例子是腦皮層中螺旋波(spiralwaves)的發現(圖10B)。螺旋波在自然界中廣泛存在,并有著不可忽視的功能和影響。比如在臺風中,螺旋波可以匯集幾百平方公里中大氣的能量而產生極大的摧毀力;在心肌中產生的螺旋波,可以破壞心肌同步收縮的協調(心室纖顫),并在瞬間使心臟停止泵血。既然大腦皮層中的興奮波是個普遍現象,那么螺旋波是否存在?是否有功能?從流體力學的原理看,產生螺旋波很容易,只需要兩個波在其傳播矢量有夾角的狀態下相遇。大腦皮層中每秒有4～10個興奮波以不同的傳播矢量掃過,產生螺旋波的機會應該是很多的。螺旋波一旦產生,其自組織特性就會使之頑強存在,并匯集能量,發揮影響。但從神經生理學的角度來看,大腦皮層的神經網絡是精確平衡和控制下的電路,不應容許不可控制的活動存在。因此,大腦皮層的神經網絡很可能存在一些控制螺旋波的機制,在某些場合下抑制螺旋波的產生,而在另一些場合,又利用螺旋波頑強存在的特征來發揮一些功能。比如,使誘發活動在感覺刺激消失后仍持續一段時間;利用螺旋波的周期性旋轉產生振蕩;或利用螺旋波中心的相位奇點(singularity)來終止網絡中大范圍的同步振蕩等。上世紀90年代,Cohen小組對烏龜視頂蓋(optictectum)進行VSD成像時發現,視覺刺激產生的興奮波有旋轉的現象,首先提示了螺旋波的存在。之后,黃小英等發現在大鼠腦片中,神經網絡去抑制后,可以有非常頑強的螺旋波,螺旋波中心的相位奇點(相當于臺風眼的結構)清晰可見(圖10B)。在后續的