microrna-192、creb、pcreb在癲癇大鼠海馬及難治性癲癇患者中的表達及意義

癲癇是一種由多種原因引起的慢性腦功能異常的慢性腦疾病，具有高度同步和異常的大腦功能異常。癲癇反復發(fā)作可導致神經元的壞死和凋亡、特異性突觸重塑、膠質增生及苔蘚纖維出芽等,其中特異性突觸重塑及苔蘚纖維出芽可促進異常興奮性環(huán)路的形成,進而發(fā)展成為難治性癲癇。大量癲癇病理生理研究研究表明,異常的軸突、樹突的生長發(fā)育形成了異常的突觸,這可能是導致異常的興奮性神經環(huán)路形成的原因之一,從而促使了癲癇的發(fā)生與發(fā)展。樹突棘位于突觸后成分中,其形成和降解的動態(tài)變化被認為是突觸可塑性的標志。Schratt等研究結果顯示microRNA-134(miR-134)可調控樹突棘的形態(tài)。CREB是神經元可塑性重要的調節(jié)因子,其磷酸化活性形式對樹突生長和樹突精細結構的調節(jié)起重要作用。而miR-134通過轉錄后機制調節(jié)CREB蛋白的表達,miR-134過表達可抑制CREB的翻譯負性調節(jié)突觸可塑性;反之則增加突觸的可塑性。本研究通過觀察難治性癲癇組與非難治性癲癇組顳葉組織、正常對照與癲癇模型大鼠海馬組織miR-134、CREB、pCREB的表達變化,探討miR-134/CREB/pCREB信號通路在癲癇發(fā)生發(fā)展過程中的可能機制。1材料和方法1.1飼養(yǎng)環(huán)境及飼養(yǎng)過程42只清潔級成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠來自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心【SCXK(渝)2012-0002】,體重(200±20)g,6~8周齡,飼養(yǎng)于環(huán)境溫度22~26℃,濕度50%~60%,12h晝夜循環(huán),自由進食及飲水的標準環(huán)境中【SYXK(渝)2010-0002】,所有試驗過程遵照重慶醫(yī)科大學動物倫理委員會的規(guī)定。將實驗動物按隨機數字表法分為對照組及癲癇點燃后1、3、7、14、30、60d組,每組6只。1.2racine分級癲癇組大鼠腹腔注射氯化鋰127mg/kg,16~20h后注射匹羅卡品35mg/kg(Sigma公司),在注射匹羅卡品30min前注射阿托品1mg/kg,發(fā)作嚴重程度按照Racine分級方法(0級:無任何反應;Ⅰ級:面部陣攣,包括眨眼、動須、節(jié)奏性咀嚼等;Ⅱ級:Ⅰ級加節(jié)律性點頭:Ⅲ級:Ⅱ級加前肢陣攣;Ⅳ級:Ⅲ級加后肢站立;Ⅴ級:Ⅳ級加摔倒),實驗動物連續(xù)3次達到IV-V級發(fā)作即被認為達到癲癇持續(xù)狀態(tài)(statusepilepticus,SE),SE點燃后45min腹腔給予地西泮10mg/kg終止發(fā)作,未達到標準的大鼠反復給予匹羅卡品10mg/kg,每15min一次,直至出現SE為止,每只大鼠總量不超過50mg/kg。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水代替匹羅卡品,其余處理同癲癇組。1.3血藥濃度及病例選擇(1)實驗中所涉及的14例難治性癲癇患者顳葉病灶標本來自第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院。進行外科手術的顳葉癲癇患者其臨床表現均達到難治性癲癇的診斷標準:正規(guī)使用3種及以上的AES藥物,血藥濃度處于維持水平,使用2年仍不能控制癲癇發(fā)作;每月癇性發(fā)作4次以上;排除其他中樞神經系統(tǒng)疾病。病灶病理改變主要為:神經元缺失、變性、膠質細胞增生,取材部位為顳葉皮質;患者平均年齡:(20.38±10.22)歲。(2)10例非癲癇對照組標本來源于第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院神經外科,患者為顱腦損傷,顱內高壓,需外科開顱減壓者。納入標準為:診斷腦外傷明確,其他非癲癇顱腦疾病引起的顱內高壓,需手術治療,術后病理檢查腦組織結構正常;無癲癇病史和家族史;取材部位為顳葉皮質。患者平均年齡:(36.80±13.01)歲。1.4試劑與檢測方法匹魯卡品(Sigma公司,美國),RNA提取、SYBRPremixExTaqTMII、RNAisoPlus、PrimeScriptRTreagentKi試劑盒(TaKaRa公司,中國大連),U6及miR-134特異性反轉錄及PCR引物(南京金斯瑞,中國南京),全蛋白提取試劑盒(凱基公司,中國南京),BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(碧云天公司,中國上海),CREB、pCREB多克隆一抗(CellSignalingTechnology,美國),NPY(武漢三鷹公司,武漢)。1.5免疫組化實驗材料(1)將術中獲得的人腦顳葉皮質標本分成兩部分:一份保存于液氮中作為RT-PCR及Westernblot的實驗材料;一份放入4%多聚甲醛中保存24h后石蠟包埋組織,并將組織切成5μm厚度,作為免疫組化實驗材料。(2)造模成功后每組3只大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛1mL/kg后斷頭取腦,分離出兩側海馬,立即浸入液氮中分別用于RT-PCR及Westernblot檢測。其余大鼠用4%多聚甲醛灌注固定后分離大腦,用石蠟包埋后冠狀位切片,厚5μm,用于免疫組織化學分析。1.6反轉錄實驗方法取液氮保存的人顳葉皮質標本及大鼠海馬組織提取總mRNA。采用RNAisoplus試劑(TaKaRa公司),按操作說明書提取。提取的總RNA樣本在加入RNase-free水完全溶解RNA沉淀后-80℃中保存。RNA的濃度和純度用260/280nm下檢測,260/280nm在1.9~2.20之間。反轉錄實驗采用TaKaR的反轉錄試劑盒,步驟為(1)37℃60min;(2)85℃5s。反應在96孔PCR板中進行,每個反應做3個復孔。PCR反應體系為20μL,RT1μL,上下游引物各0.5μL,SYRBGreen熒光染料(TaKaRa公司)10μL,去離子水8μL。反應條件為(1)95℃,30s;(2)95℃,5s,60℃,20s,40個循環(huán)。miR-134和β-actin的標準曲線保證擴增的效率在90%~110%之間。擴增和溶解曲線及數據用Bio-RadCFXManager軟件分析。實時定量PCR雙向引物序列:miR-134:5'-GGGGTGTGACTGGTTGAC-3'(南京金斯瑞,中國),U6:F:5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3':R:5'-CGCTICACGAATITGCGTGTCAT-3'。結果用平均2-ΔΔCT法進行分析。1.7膜上條帶檢測人顳葉皮質組織、海馬組織提取全蛋白,根據全蛋白提取試劑盒說明提取,BCA法檢測蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白:轉膜采用全濕法,按照3張濾紙、PVDF膜、完成電泳的膠、3張濾紙的順序依次排放,250mA電流電轉1h;5%脫脂奶粉37℃封閉1h;分別加入PBS稀釋過的marker蛋白(β-actin,1∶1000)、兔多克隆CREB一抗(1∶100)及兔多克隆pCREB一抗(1∶50),4℃冰箱過夜;TBST搖洗10min×4次;加入TBST稀釋的HRP標記的山羊抗兔二抗(1∶4000),與膜37℃孵育1h;再次TBST搖洗10min×4次;ECL顯色。應用QuantityOne圖像分析軟件,計算PVDF膜上條帶的光密度值。用目的條帶的光密度值比相應內參β-actin條帶的光密度值得到該蛋白在組織中的表達量。1.8正常臨床資料將組織切片在二甲苯中脫蠟,梯度酒精中脫水。自來水沖洗5min,PBS磷酸鹽緩沖液中浸泡3min后于3%H2O237℃反應10min,以滅活內源性過氧化物酶,PBS緩沖液沖洗3min×3次,用枸櫞酸抗原修復,煮沸3min,92~98℃15min,室溫自然冷卻后PBS緩沖液沖洗5min×3次,滴加正常山羊封閉血清,37℃30min;甩去多余血清加入稀釋后的兔多克隆CREB一抗(1∶400),兔多克隆pCREB一抗(1∶100),陰性對照組用PBS代替一抗,4℃冰箱中過夜,第二日37℃孵育60min復溫,PBS緩沖液沖洗5min×3次,滴加生物素標記羊抗兔二抗工作液(中杉金橋),37℃30min,PBS沖洗5min×3次,辣根酶標記鏈酶卵白素工作液(中杉金橋)37℃30min,PBS沖洗5min×3次,DAB顯色,經蘇木素復染,酒精梯度脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片。采用奧林巴斯BX51自動圖片采集系統(tǒng)采集圖片。1.9數據統(tǒng)計分析使用SPSS17軟件對數據進行統(tǒng)計學分析,對計量資料數據進行正態(tài)性檢驗,采用均數±標準差(ue0af±s)表示,兩組均數比較采用t檢驗,多組均數采用單因素方差分析中的LDS檢驗,P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。2結果2.1mir-133的表達水平在大鼠癲癇點燃后72h(0.026±0.014)、7d(0.021±0.007)、14d(0.008±0.005)、60d(0.015±0.004)miR-134的表達水平相對于正常對照組(0.034±0.017)表達明顯降低(P<0.05),14d達到最低,而在1d(0.031±0.018)、30d(0.030±0.012)時間點無明顯差異(P>0.05);在難治性癲癇患者顳葉皮質中miR-134的表達(0.062±0.039)較對照組(0.137±0.086)明顯降低(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。見圖1。2.2經過streambft檢測結果2.2.1兩組不同時點石壓0.420.05的變化CREB在人顳葉皮質及大鼠海馬中均有表達,在癲癇大鼠點燃成功后1d(0.214±0.088)及30d(0.273±0.117)表達較對照組(0.225±0.04)無明顯變化(P>0.05),在3d(0.423±0.123)、7d(0.416±0.079)、14d(0.44±0.054)、60d(0.382±0.052)較對照組明顯增加(P<0.05);人顳葉皮質中難治性癲癇組CREB表達(0.335±0.177)較非難治性癲癇對照組表達(0.180±0.068)增加(P<0.05),差異具有顯著性。見圖2。2.2.2組蛋白表達比較pCREB在人顳葉皮質及大鼠海馬中均有表達,在癲癇大鼠點燃成功后1d(0.386±0.055)、3d(0.425±0.082)、7d(0.379±0.074)、14d(0.517±0.126)、30d(0.492±0.037)、60d(0.441±0.075)表達較對照組(0.174±0.045)均明顯增加(P<0.05);人顳葉皮質中難治性癲癇組pCREB表達(0.43±0.18)較非難治性癲癇對照組表達(0.27±0.115)增加(P<0.05),差異有顯著性。見圖3。2.3免疫組化的結果2.3.1兩組癲癇模型creb的表達比較癲癇大鼠腦組織的海馬區(qū)CREB陽性表達主要見于齒狀回、CA1及CA3區(qū)神經元胞核。癲癇模型組72h時間點CREB表達明顯多于正常對照組見圖4(彩插3)。人顳葉皮質中CREB陽性表達主要存在于神經元細胞核中,且癲癇組明顯多于對照組見圖5(彩插3)。2.3.2對ca3區(qū)神經元胞核的影響癲癇大鼠腦組織的海馬區(qū)pCREB陽性細胞主要見于齒狀回、CA1及CA3區(qū)神經元胞核。癲癇模型組72h時間點CREB表達明顯強于正常對照組見圖6(彩插2)。人顳葉皮質中pCREB陽性表達主要存在于神經元細胞核中,且癲癇組明顯多于對照組見圖7(彩插2)。3mir-133在癲癇臨床中的作用顳葉癲癇是一種常見的慢性神經系統(tǒng)疾病,其特征為復發(fā)性癲癇。大量病理研究分析表明,苔蘚纖維出芽(mossyfibersprouting,MFS)和特異性突觸重組是造成難治性癲癇的主要病理基礎,其中MFS是突觸重組的主要形式,廣泛存在于難治性癲癇患者標本和癲癇動物模型中。氯化鋰-匹羅卡品大鼠是理想的顳葉癲癇模型,急性期表現為癲癇持續(xù)狀態(tài),隨后有大約兩周的潛伏期是異常興奮性環(huán)路形成的關鍵時期并伴隨動物一生,慢性期主要表現為自發(fā)性反復發(fā)作,這與人類難治性癲癇的發(fā)生發(fā)展機制較為相似。眾多研究顯示,microRNA(miR)是一類長20bp左右具有高度保守性的,內源性非編碼小RNA,其作為廣泛存在與哺乳動物中樞神經系統(tǒng)中的基因表達調控因子,在神經系統(tǒng)發(fā)育、神經細胞分化、樹突生長和突觸重組中起重要作用。它主要通過核酸特異性序列的互補結合,在蛋白質翻譯水平降解靶mRNA或抑制其表達,從而起到沉默基因、調控表達的作用。越來越多研究表明,樹突棘作為突觸后成分,是突觸后興奮性傳導的重要部位,突觸重塑與腦中一些特殊表達的miR密切相關。miR-134是腦內一種特殊的小RNA,廣泛分布于海馬神經元上,參與調控神經元的微觀結構,負性調節(jié)樹突棘的大小并通過調節(jié)樹突功能而參與癲癇的病理發(fā)生過程。miR-134過表達可減小樹突棘的體積。對臨床標本檢測中,miR-134在難治性癲癇組表達明顯低于非癲癇組;在動物實驗中,miR-134在癲癇大鼠模型成功點燃后72h開始下降,直到60d仍保持低水平,人及動物標本中這種在癲癇慢性期長期保持低水平的狀態(tài)可能與癲癇慢性期重塑后的突觸穩(wěn)定性增加,及穩(wěn)定的異常神經網絡形成有關。CREB存在于腦內所有細胞細胞核中,是轉錄因子蛋白家族的成員,參與了許多細胞內信號通路的信號傳遞,有研究表明CREB可促進記憶涉及新的突觸聯(lián)系生長或形成。當細胞膜受到刺激時可引起胞內CREB的轉錄發(fā)生變化,而CREB則通過改變靶基因的表達,調節(jié)神經元所有類型蛋白的表達,進而影響單個神經功能最終影響整個神經回路。在發(fā)育成熟神經元中,轉錄因子CREB在樹突生長和活性調節(jié)樹突的精細結構方面起重要作用,其調節(jié)基因轉錄的關鍵步驟包括二聚體形成,結合到DNA反應原件以及磷酸化。CREB蛋白的生物學活性受磷酸化的調控,磷酸化作用可以增強CREB的轉錄活性。miR-134通過轉錄后機制調節(jié)CREB蛋白的表達,在正常狀態(tài)下,miR-134對CREB蛋白的表達起抑制作用,miR-134表達增加,對CREB的抑制加強;反之,miR-134表達降低對CREB蛋白的翻譯抑制作用解除導致CREB表達升高,并增加其磷酸化的功能活性形式(pCREB)含量,具有功能活性的pCREB可促進下游miR-132表達上調進而激活相關信號通路,導致細胞骨架肌動蛋白聚合,增加樹突棘的密度及體積最終調節(jié)突觸的可塑性,促使苔蘚纖維出芽形成異常神經網絡,導致癲癇長期反復發(fā)作及耐藥。在癲癇臨床標本及動物模型中CREB與pCREB表達較對照組均明顯且保持上升,CREB磷酸化