抑制socs1表達對life激活的肝癌樹突狀細胞疫苗效應的影響

c型腫瘤是最具潛力的獨特抗生素細胞（apc）。腫瘤免疫治療是腫瘤免疫治療的重要組成部分。DC的功能依賴其分化成熟狀態(tài),成熟DC才能有效激活腫瘤免疫應答,而未成熟DC會誘導免疫耐受,因此如何確保DC成熟成為腫瘤疫苗中的關鍵問題。LIGHT是新的TNF超家族的成員,可上調DC表面共刺激分子表達并誘導其成熟。SOCS1是對細胞因子起負調節(jié)作用的重要分子,與T細胞、DC的分化以及腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關,在前期研究中發(fā)現SOCS1在LIGHT誘導DC成熟中起負調節(jié)作用,本研究利用LIGHT刺激負載肝癌抗原DC成熟,用特異寡核苷酸對其起負調節(jié)的SOCS1進行處理來制備疫苗,并對其刺激T細胞應答進行了初步探討,為肝癌疫苗制備提供新思路。1材料和方法1.1實驗動物及其研物BALB/c小鼠,雌性,6～8周齡,購于中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所;小鼠肝癌細胞株HepA、小鼠肺癌細胞株LL2由本院腫瘤研究室傳代培養(yǎng)。1.2轉染試劑和材料重組小鼠LIGHT(rmLIGHT)、重組小鼠粒-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和白介素4(rmIL-4)購于R&D公司;全硫代修飾的SOCS1反義寡核苷酸(AS1)及非特異核苷酸(NS1)堿基序列分別為:5′-CACCTGGTTGCGTGCTACCATCCTAC-3′,5′-CAGCTCGTAGCGAGCAACCATCGTAC-3′,由寶生物工程(大連)有限公司合成;LipofectamineTM2000轉染試劑購自Invitrogen公司;單克隆抗體FITC-CD11c(克隆號N418)、FITC-CD40(HM40-3)、FITC-CD86(PO3)購于BDPharmingen公司;小鼠白細胞介素1(mIL-1)、白細胞介素6(mIL-6)、白細胞介素12(mIL-12)及TNF-βELISA檢測試劑盒購自Biotec公司;培養(yǎng)基RPMI1640購自GIBCO公司,加入含15%滅活的小牛血清、100μg/mL鏈霉素、100U/mL青霉素制成完全培養(yǎng)基。1.3組不同時間點換液1次用凍融法制備HepA細胞抗原(HAg),參照文獻的方法分離BALB/c小鼠下肢股骨骨髓細胞懸于完全培養(yǎng)基,調細胞密度為1×106/mL,加rmGM-CSF至8ng/mL、rmIL-4至4ng/mL,37℃,5%CO2恒溫孵育。每2.5d換液1次。第4d時,分為各組:DC(單純DC組)、DC+HAg(抗原處理DC組)、DC+LIGHT(LIGHT刺激DC組)、DC+AS1(AS1處理DC組)、DC+HAg+LIGHT(抗原和LIGHT共刺激DC組)、DC+HAg+AS1(抗原和AS1共處理DC組)、DC+HAg+LIGHT+AS1(抗原、LIGHT和AS1共處理DC組)、DC+HAg+LIGHT+NS1(抗原、LIGHT和NS1共處理DC組)。按分組分別進行處理:加入HAg(500μg/mL)培養(yǎng)24h后,用LipofectamineTM2000轉染AS1或NS1,轉染24h后,加入LIGHT至終濃度為50ng/mL,DC細胞繼續(xù)培養(yǎng)至24h后,收集細胞,即為負載肝癌抗原DC疫苗和相應的對照組細胞。1.4成熟樣品的測定1.4.1細胞表面表達分別收集各組細胞,加入1∶100稀釋的大鼠抗小鼠單抗FITC-CD40、FITC-CD86,流式細胞儀檢測細胞表面分子表達,標記熒光的細胞為陽性細胞,BiosConsort30軟件處理數據,以平均熒光強度(meanfluorescenceintensity,MFI)為CD40、CD86的表達水平。1.4.2培養(yǎng)基的制備收集各組細胞以1×106/mL的密度接種于6孔板內,每孔加入1mL完全培養(yǎng)基,37℃、5%CO2孵箱內培養(yǎng)24h。離心收集上清,-20℃保存。按照試劑盒說明步驟用ELISA法檢測各組DC培養(yǎng)上清中IL-12及IL-1的分泌水平,酶標儀490nm波長下測定吸光度(A)值,計算濃度。1.5ctl活性測定制備效應細胞(E):將BALB/c小鼠按1.3所述DC疫苗分組,每組10只,將制備的不同DC疫苗以2×106細胞/只腹腔注射免疫小鼠,同時設生理鹽水對照組(0.2mL/只),每周1次,連續(xù)2周。第2次免疫1周后處死小鼠,常規(guī)方法制成脾淋巴細胞懸液備用。分別以HepA細胞和LL2細胞為靶細胞(T),靶細胞6×104/孔,按效應細胞數與靶細胞數比例(E∶T)為100∶1、50∶1、25∶1分別加入效應細胞,每種比例設3個復孔,同時設空白對照孔和無效應細胞的最大釋放孔。參照文獻采用乳酸脫氫酶法測定CTL活性,酶標儀測定570nm波長A值。計算殺傷率。CTL殺傷率(%)=實驗孔A570?空白對照孔A570最大釋放孔A570?空白對照孔A570×100%(%)=實驗孔A570-空白對照孔A570最大釋放孔A570-空白對照孔A570×100%1.6胞/孔增殖指數測定取經1.5制備的各組脾淋巴細胞懸液,加入96孔平底板,4×105細胞/孔,每組3個復孔,同時設空白對照孔,MTT法測定570nm處光密度(OD)值,比較淋巴細胞的增殖指數。增殖指數(SI)=實驗孔OD均值空白對照孔OD均值(SΙ)=實驗孔ΟD均值空白對照孔ΟD均值1.7elisa法檢測il-6及tnf-表達水平分別收集各組淋巴細胞增殖反應培養(yǎng)96h后的上清,按照試劑盒說明步驟用ELISA法檢測各組培養(yǎng)上清中IL-6及TNF-β分泌水平,酶標儀490nm波長下測定A值,計算濃度。1.8統(tǒng)計方法實驗數據用均數±標準差表示。多組間比較采用方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1兩組共享血壓指標比較見表1結果見表1。有AS1阻斷SOCS1、LIGHT和抗原刺激的條件下(DC+HAg+LIGHT+AS1組)的DC成熟度最高,表達CD40、CD86及分泌IL-12、IL-1的能力最強,與其他各組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。在有LIGHT和HAg共同刺激情況下(DC+HAg+LIGHT和DC+HAg+LIGHT+NS1組),雖然DC的成熟度低于DC+HAg+LIGHT+AS1組(P<0.05),但仍高于其它各組(P<0.05)。其他各組間差異無統(tǒng)計學意義。MFI:Meanfluorescenceintensity;*P<0.05,vsDC+HAg+AS1,DC+AS1,DC+LIGHT,DC+HAgandDCgroups;#P<0.01,vsothergroups2.2ctl活性的比較結果見表2。以HepA細胞為靶細胞時(100∶1和50∶1),在AS1阻斷SOCS1、LIGHT和抗原刺激的條件下(DC+HAg+LIGHT+AS1組)DC激活的CTL活性最強(P<0.01),DC+HAg+LIGHT和DC+HAg+LIGHT+NS1組的CTL活性低于DC+HAg+LIGHT+AS1組(P<0.05),但仍高于其它各組(P<0.05),其他各組間差異無統(tǒng)計學意義;當E∶T為25∶1時,各組的CTL活性差異無統(tǒng)計學意義。各組對LL2細胞的殺傷活性的差異均無統(tǒng)計學意義。2.3ctl活性測定結果見表3。DC+HAg+LIGHT+AS1組DC誘導淋巴細胞增殖能力最強(P<0.01)。DC+HAg+LIGHT和DC+HAg+LIGHT+NS1組的CTL活性低于DC+HAg+LIGHT+AS1組(P<0.05),但仍高于其它各組(P<0.05)。其它各組之間差異無統(tǒng)計學意義。SI:Stimulationindex;*P<0.05,vsDC+HAg+AS1,DC+AS1,DC+LIGHT,DC+HAgandDCgroups;#P<0.01,vsothergroups2.4比較結果見表1結果見表3。IL-6和TNF-β分泌水平在DC+HAg+LIGHT+AS1組最高,與其它各組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而在DC+HAg+LIGHT和DC+HAg+LIGHT+NS1組低于DC+HAg+LIGHT+AS1組(P<0.05),但仍高于其它各組(P<0.05)。其它各組之間差異無統(tǒng)計學意義。3socs1在dc成熟過程中的負調節(jié)作用DC是唯一能促使初始型T細胞增殖的APC,以其在抗原識別、加工提呈、T細胞激活以及免疫耐受中發(fā)揮的重要作用而在機體免疫系統(tǒng)中占有重要地位。不同成熟度的DC功能不同,不成熟DC(iDC)具有較強的吞噬能力和抗原加工處理功能,但不能激活初始型T細胞,反而會導致免疫耐受。成熟DC(mDC)吞噬能力下降,而具有抗原提呈能力,能激活T細胞,誘導機體產生抗原特異性CTL。因此,設法增加DC的成熟度,啟動有效的免疫反應,成為DC介導的免疫治療的關鍵問題。LIGHT是1998年新發(fā)現的TNF超家族的成員,可通過激活NF-κB信號通路上調DC表面共刺激分子表達并誘導其成熟,共刺激T細胞,加強抗原特異性的CTL反應。在前期報道中發(fā)現在利用LIGHT誘導DC成熟時,SOCS1亦被同時誘導表達,起到了負調節(jié)作用。SOCS1是影響細胞因子信號傳導的重要分子,與T細胞、DC的分化以及腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關,是許多細胞因子信號傳導的負調節(jié)分子。進一步的研究表明,SOCS1在細胞因子誘導的DC分化成熟過程中起著重要作用。SOCS1蛋白的高表達依賴于JAK/STAT和NF-κB介導的細胞因子信號途徑的激活,反過來,SOCS1蛋白的高表達又對JAK/STAT和NF-κB信號傳導進行負反饋調節(jié)。DC的成熟依賴于Toll-like受體(TLR)和IFN信號,SOCS1可能通過調控IFN/JAK/STATS或TLR/NF-κB調節(jié)DC的信號傳導,從而調控影響DC成熟的因素。本研究探討了SOCS1在LIGHT促進DC疫苗細胞成熟過程中的作用,用反義寡核苷酸技術封閉負載抗原的DC中的SOCS1基因,抑制其表達,發(fā)現在抑制SOCS1表達的條件下(DC+HAg+LIGHT+AS1組),DC疫苗細胞的成熟度更高,其表面共刺激分子CD40、CD86的表達以及IL-12、IL-1的分泌顯著高于其它各組,提示抑制SOCS1的繼續(xù)表達能有效克服LIGHT刺激DC成熟過程中已有的SOCS1表達增加對DC成熟進程的抑制作用,從而確保DC疫苗細胞的抗原有效提呈。此外,本研究就抑制SOCS1對LIGHT刺激肝癌DC疫苗的激活T細胞功能進行了觀察,體外CTL活性實驗顯示在LIGHT刺激下的DC疫苗經抑制SCOS1處理后(DC+HAg+LIGHT+AS1組),其激活特異性的CTL活性明顯提高,說明在制備肝癌DC疫苗時,有必要考慮到SOCS1引起的負調控帶來的免疫抑制問題,通過抑制DC疫苗細胞SOCS1的