馬鈴薯葉片耐鹽突變體篩選

土壤中的養分過多會對植物產生損害，稱為鹽害。當前對于鹽漬土的開發利用主要采取兩種措施:一是通過工程來改良鹽堿土壤;二是生物治理,即通過農業生物技術培育耐鹽作物品種或開發利用有經濟價值的鹽生植物資源以改良土壤。前者雖取得了一定的效果,但因耗資巨大,難以長久保持,因此人們更寄希望于后者,希望通過生物技術手段最終達到改良利用鹽堿地的目的。馬鈴薯對鹽害較敏感,鹽漬化土壤不利于其生長。因此,選育耐鹽馬鈴薯品種具有很重要的經濟效益和社會效益,尋找一種高效的馬鈴薯抗鹽育種途徑已成為重要的研究課題。雖然馬鈴薯病毒病莖尖組培脫毒技術的研究基礎比較成熟,馬鈴薯愈傷組織抗病變異株的篩選工作也有研究報道。但利用馬鈴薯體細胞無性系變異進行耐鹽突變體的篩選,國內外尚未見報道。本研究以4個馬鈴薯栽培品種的葉片為外植體進行耐鹽突變體篩選,現將結果報道如下。1材料和方法1.1材料表面供試4個馬鈴薯品種分別為費烏瑞它、東農303、夏波帝、鄂1號。1.2培養基的制備葉片愈傷組織的誘導培養基:東農303、鄂1號兩品種為MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.2mg/L;費烏瑞它為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L;夏波帝為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L。葉片愈傷不定芽誘導培養基:費烏瑞它、鄂1號的最佳分化培養基為MS+6-BA2.5mg/L+GA35.0mg/L;東農303為MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L+GA32.5mg/L;夏波帝為MS+6-BA2.5mg/L+IAA0.5mg/L+GA32.5mg/L。篩選方法采用一步直接篩選法,即將外植體直接培養在含鹽培養基上進行篩選。具體方法為:取幼嫩葉片,在含0,2,4,6,8,10,12,14,16g/LNaCl的鹽脅迫培養基中,一次直接誘導產生耐鹽愈傷組織,培養觀察愈傷組織的誘導和生長情況,將產生的愈傷組織在含相應鹽質量濃度的培養基中進行繼代培養。1.3小鹽懸液耐鹽愈傷組織的誘導將經6,8,10,12次繼代培養的耐鹽愈傷組織及其對照分別接種到無鹽和含鹽培養基上進行不定芽誘導。每處理接種15瓶,每瓶接種4塊愈傷組織。1.4抗鹽突變體的生根和植物再生將通過耐鹽愈傷組織誘導形成的不定芽培養在含鹽與無鹽生根培養基上,進行根的誘導。1.5耐鹽突變體的測定方法1.5.1同鹽質量濃度的鹽水灌溉處理選一定大小(植株高10cm左右)的已生根幼苗植株進行盆栽,馴化移栽成活后進行不同鹽質量濃度的鹽水灌溉處理(費烏瑞它的耐鹽再生植株澆鹽水濃度為6g/L,東農303為8g/L,夏波帝為4g/L,鄂1號為8g/L)。每周1次,每次澆鹽水50mL,直到對照植株(未經過鹽脅迫篩選的再生植株)死亡,記載耐鹽再生植株的死亡數。1.5.2耐鹽植物后代的耐鹽性(1)耐鹽突變體的后代對nacl的等待反應將1cm長的莖尖接種到分別附加0,5,8g/LNaCl培養基上,培養30d后統計芽體的生根率、鮮重和干重。每處理重復30次。(2)愈傷組織的誘導用篩選出的耐鹽突變體的葉片和莖段作外植體,進行愈傷組織的誘導測定。在附加0,5,8g/LNaCl培養基上培養30d后測定愈傷組織鮮重與干重。每處理重復30次。2結果與分析2.1外植體愈傷組織發生從表1可以看出,在愈傷誘導過程中,接種在含鹽培養基上的各品種的外植體愈傷生長量均受到不同程度的抑制,且隨鹽質量濃度的升高抑制作用增強。以馬鈴薯鄂1號品種為例,其受鹽脅迫的動態過程為:將葉片直接接種在含鹽培養基上進行培養,5d內外植體在各鹽質量濃度之間無明顯差異。隨后高鹽培養基中的葉片逐漸失綠,并隨鹽質量濃度的升高失綠嚴重。15d后觀察發現,含鹽培養基上的外植體愈傷組織生長緩慢。對照中接種的葉片邊緣已卷起,愈傷組織布滿下表面;含鹽培養基中的葉片邊緣微有膨大現象,隨鹽質量濃度的增大邊緣膨大減弱。NaCl為14,16g/L時明顯抑制愈傷組織誘導,部分葉片干枯死亡。接種后20d,對照愈傷量明顯多于其他處理,2,4g/LNaCl脅迫處理抑制程度較輕,外植體表面布滿淡綠色愈傷組織;6g/LNaCl處理部分外植體形成了少量愈傷組織,NaCl達到8g/L時,葉片膨大的邊緣逐漸黃化,繼續增加NaCl質量濃度,葉片泛黃明顯,膨大邊緣褐化,部分死亡。30d后觀察發現,NaCl為2g/L處理的愈傷組織量與對照沒有明顯差別,愈傷組織新鮮,有米粒狀突起;4g/LNaCl處理的愈傷組織也有明顯生長,但隨NaCl質量濃度的加大,愈傷組織形成量減少,超過12g/L時外植體黃化干枯。30d的動態觀察表明,外植體在含鹽培養基上培養,受抑制程度隨鹽質量濃度增加而加劇,適應時間隨鹽質量濃度升高而延長。2.2代樣品的連續篩選由表2可知,不同品種葉片愈傷組織耐鹽性不同,表現在鹽的最高耐受質量濃度不同,相同鹽質量濃度下達到穩定生長狀態所需的繼代次數不同。費烏瑞它經連續篩選可達到的最高鹽耐受質量濃度為6g/L,其耐4g/LNaCl的變異體選擇培養至第4代已基本穩定,愈傷組織的相對生長量已接近對照,篩至第7代時愈傷組織相對生長量已超過對照;耐6g/LNaCl的變異體在第8代時愈傷相對生長量接近對照,第10代時相對生長量超過了對照。東農303經過連續8代的篩選可以獲得耐受8g/LNaCl的愈傷組織,夏波帝經過連續5代篩選能耐受4g/LNaCl,鄂1號經過連續篩選8代達到8g/LNaCl的最高鹽耐受質量濃度。相對生長量的逐漸提高表明,愈傷組織經過多次在含鹽培養基上的繼代可以獲得穩定生長的耐鹽愈傷組織,并隨繼代培養次數的增多,對鹽的耐受質量濃度不斷得到提高。2.3種分離菌株的分化率不同繼代次數的葉片愈傷組織分化率見表3。表3表明,葉片的對照愈傷組織在含鹽的分化培養基上不能分化,在無鹽培養基中繼代到第10次還有一定程度的分化,費烏瑞它的分化率可達55.4%,繼代次數增加到12次時,分化率均急劇下降,鄂1號則失去了分化能力,夏波帝的分化率也降低到3.4%。說明對照愈傷組織在無鹽培養基中連續繼代10次以后,愈傷組織的分化能力會明顯降低。耐鹽愈傷組織在無鹽培養基中繼代10次時,東農303的分化率最高為20.3%;繼代12次時4個品種均未能分化;在含鹽培養基上,繼代8次的耐鹽愈傷組織的分化率已經降到8.5%~11.2%,繼代10次,費烏瑞它、東農303、鄂1號已經不能分化。2.4無鹽培養基上的耐鹽植物生長的變化將分化形成的不定芽分別培養在含鹽與無鹽培養基上,由表4的生根情況可以看出,經過30d的根誘導培養,在無鹽培養基中變異體的生根率與對照無明顯差異,生根率均在90%以上。但根的質量有所不同,突變體形成的根數量多、粗壯,根短;對照的根較長,但根的數量相對較少。在含鹽培養基上無論對照還是突變體均未分化形成根,突變體無根苗表現生長慢,而對照很快出現枯死現象。因此可以看出,在含鹽培養基中根的分化也受到抑制,這與前面芽的分化受到抑制是一致的。上述得到的耐鹽再生植株在含鹽培養基上生長正常,而且形成小分枝,生長速度比對照植株在無鹽培養基上生長的略慢,但比對照植株在含鹽培養基上的生長要快得多,植株比較健壯。對照植株在含鹽培養基上經過40d的培養后莖葉明顯發黃,靠近培養基的部位變黑,平均高度不到2cm,而且形態不正常。2.5鹽突然變化體的確定2.5.1突變體的存活率對耐鹽變異株進行盆栽澆鹽水試驗結果表明,其耐鹽性明顯高于對照,在6g/LNaCl脅迫下,費烏瑞它與夏波帝的突變體植株和4個品種的對照植株全部死亡,東農303的突變體植株存活率為45.6%,鄂1號的存活率為77.3%。2.5.2無鹽培養基上莖尖的生長情況耐鹽突變體后代莖尖對NaCl脅迫的反應見表5。由表5可以看出,所有耐鹽突變體后代的莖尖對鹽分脅迫都有一定的適應性。在8g/LNaCl脅迫下,耐鹽突變體后代莖尖的生根率在不同品種間存在明顯差異,東農303的生根率為33.7%,鄂1號為44.3%,兩者對照未見根的發生,生根率為0。東農303在無鹽培養基上莖尖鮮重較對照生長得慢,但在5與8g/L的含鹽培養基上生長速度幾乎是對照的2倍,鄂1號也表現出類似的現象。干重的變化趨勢與鮮重的變化一致。說明所獲得的耐鹽突變株在鹽脅迫下具有較強的生長能力。將耐鹽突變體后代葉片、莖段在含鹽培養基上進行愈傷誘導,并觀察其生長狀況,結果(表6)表明,突變體后代的葉片、莖段保留了其對鹽脅迫的適應性,與對照相比愈傷組織鮮重與干重在5,8g/LNaCl下均有較明顯的生長,愈傷鮮重幾乎是對照的2倍,特別是變異株在5g/LNaCl水平下葉片與莖段愈傷比空白培養基中鮮重、干重有所增加,而對照下降幅度較大,因此可以說明篩選出的突變體選擇壓高時,其后代的愈傷組織耐鹽性也較高。3耐鹽能力的篩選獲得耐鹽愈傷組織一般有兩類方法,一是將外植體直接接種到含鹽培養基上誘導耐鹽愈傷組織,二是將普通的愈傷組織轉移到鹽質量濃度恒定或逐次遞增的培養基上通過多次繼代,選出穩定生長的愈傷組織。前人研究表明,兩種方法都能獲得耐鹽愈傷組織,但Nabors等對煙草耐鹽離體篩選的研究認為,在鹽脅迫條件下能否產生耐鹽突變體與添加鹽的質量濃度和篩選時間有關。在低水平選擇壓力下有利于形成生理適應性細胞,但不利于突變細胞的產生。選擇壓力必須大到足以抑制絕大多數細胞分裂和生長的程度,正常細胞幾乎不能生長、分裂的情況下才有可能篩選出突變的細胞。所以本研究采用了一步直接篩選法,以期獲得真正的耐鹽突變植株,而不是鹽適應性植株。耐鹽能力的穩定性檢驗需要一個長期的過程,要經過多次大田實際檢驗才能進一步驗證耐鹽能力的可遺傳性,本研究的檢驗可能與實際大田栽培中植株的耐鹽能力還有較大差距,需進一步深入的研究探討。在篩選具有分化能力的耐鹽愈傷組織時,許多材料的愈傷組織或培養細胞經過長期的抗性篩選后,喪失了再生形成植株的能力。培養耐鹽突變體需要長時間的鹽脅迫篩選,而長時間的培養會影響愈傷分化。本研究認為,采用高鹽