box-behnken響應曲面法優化毛果魚藤總黃酮提取工藝及其體外抑菌作用考察

毛果魚藤是豆科植物毛果魚藤的一種干燥的根和藤蔓，也被稱為土甘草，主要分布在廣東、廣東等地。毛果魚藤具有利尿除濕、鎮咳化痰的功效,常用于廣西壯族民間驗方,如治療膀胱炎、腎炎、尿道炎、咳嗽等癥狀。因其民間用藥的顯著療效,引起了越來越多研究人員的關注。黃酮類化合物是毛果魚藤中主要的活性成分,有研究表明黃酮類化合物具有抗炎、抗HIV、抗癌、抗氧化、降血脂、降血壓、降血糖等作用。近年來,國內有關毛果魚藤的研究主要有資源調查,藥材性狀、薄層、紫外光譜的鑒別以及抗炎鎮痛、止咳祛痰等藥理、毒理學方面的研究,但對其提取工藝、生物活性等方面的研究甚少,對其總黃酮提取工藝及抑菌作用的研究尚未見報道。采用BoxBehnken響應曲面法,可將各因素與響應值之間的函數關系用多項式進行擬合,通過對回歸方程以及響應面的分析尋求最佳工藝條件;采用紙片擴散法考察總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌、變形桿菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠球菌和溶血性鏈球菌的抑菌作用。本研究以毛果魚藤為原料,采用Box-Behnken響應面分析法對毛果魚藤總黃酮的提取工藝進行優化,可為高效率地提取毛果魚藤總黃酮成分及進一步開發其藥理作用提供可靠的實驗依據,同時也為進一步開發和合理利用毛果魚藤這一藥用植物資源提供了參考數據。1設備和材料1.1催化合成/萃取儀UVmini-1240分光光度計(Shimadzu公司);XH-100A微波催化合成/萃取儀(北京祥鵠科技發展有限公司);SB-3200DTDN超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司);ZHJH-1109B超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司);HHB11電熱恒溫培養箱(天津市實驗儀器廠)。1.2藤莖及毛果魚藤莖營養瓊脂(天津市英博生化世紀有限公司)。陽性對照藥:鹽酸左氧氟沙星(山東魯抗醫藥,130701)、阿莫西林膠囊(先聲藥業,02-130701)、氨芐青霉素鈉(Sigma公司)、制霉菌素(Kayon公司)。毛果魚藤藤莖購自廣西靖西,經廣西中醫藥大學田輝教授鑒定為毛果魚藤DerriseriocarpaHow藤莖。蘆丁對照品購于中國食品藥品檢定研究院(批號100080-200707)。1.3病毒金黃色葡萄球菌、變形桿菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠球菌、溶血性鏈球菌由廣西民族大學海洋與生物技術實驗室提供。2結果與分析2.1alno33樣品的制備取蘆丁對照品25mg,用無水乙醇溶解,定容到25mL量瓶中,搖勻,配制成質量濃度為1mg/mL的蘆丁標準溶液,保存,備用。取上述蘆丁標準溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于25mL量瓶中,分別加入5%NaNO2溶液1mL,搖勻,靜置6min后加入10%Al(NO3)3溶液1mL,搖勻,靜置6min后加入4%NaOH溶液5mL,定容至25mL。搖勻,靜置5~10min后,于510nm波長處測定吸光度,每份樣品均檢測3次。以標準溶液的質量濃度為橫坐標,以吸光度為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程:y=2.3065x-0.0512,r=0.9997。2.2黃酮提取過程的優化2.2.1單因素試驗2.2.1.樣品前處理稱取毛果魚藤5份,每份2.0g,70℃,400W功率,用20倍體積的95%乙醇分別提取10、15、20、25、30min,提取2次,定容到100mL量瓶中,在510nm測定,所有樣品均檢測3次。結果(見圖1)表明,隨著提取時間的延長,總黃酮提取量逐漸增加,但當提取時間達25、30min時提取率改變不大,從節約能源等因素考慮,選擇25min為最佳提取時間。2.2.1.樣品的提取稱取毛果魚藤5份,每份2.0g,70℃,用20倍體積的95%乙醇分別在功率為300、400、500、600、700W提取25min,提取2次,定容到100mL量瓶中,在510nm測定,所有樣品均檢測3次。結果如圖2所示,隨著提取功率的增大,在500W處出現小高峰,此后隨著功率繼續增加,提取量呈下降趨勢,故功率選擇500W為宜。2.2.1.3.乙醇體積比對總黃酮提取率的影響2.2.1.樣品中乙醇提取稱取毛果魚藤5份,每份2.0g,70℃,功率為500W,料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50,用85%的乙醇提取25min,提取2次,定容到100mL量瓶中,在510nm測定,所有樣品均檢測3次。結果如圖4所示,隨著料液比增加,黃酮提取率也隨之增加,當料液比達到1∶40出現最高點,繼續增大料液比提取率變化不大,從減少試劑用量和保證提取效率的綜合因素考慮,選擇最優的料液比為1∶40。2.2.1.提取次數的測定稱取毛果魚藤份5份,每份2.0g,70℃,功率500W,料液比分別為1∶40,用85%乙醇提取25min,分別提取1次、2次、3次,定容到100mL量瓶中,在510nm處測定,所有樣品均檢測3次。結果如圖5所示,隨著提取次數的增加,提取率逐漸增加,提取次數由2次到3次時,總黃酮提取率增加的幅度不大,說明總黃酮已提取完全,故提取次數選2次為宜。2.2.2毛果魚藤總黃酮提取工藝優化綜合單因素試驗結果,選取影響毛果魚藤總黃酮提取率的提取時間(A)、料液比(B)和乙醇體積分數(C)這三個主要因素作為考察因素,以總黃酮提取率為試驗指標,采用Design-Expert8.0.6b軟件結合Box-Behnken設計法優化毛果魚藤總黃酮提取工藝。每因素設3水平,用代碼-1、0、+1表示,試驗因素水平及編碼見表1。2.2.2.毛果魚藤黃酮提取模型擬合應用Design-Expert8.0.6b軟件中Box-Behnken設計分析方案,試驗結果如表2所示,試驗組1~12是析因試驗;試驗組13~17是中心試驗,試驗重復5次。采用Design-Expert軟件對表2所得的數據進行統計分析,分析結果如表3所示。對各因素進行回歸擬合,得到回歸方程如下:式中:A為提取時間、B為料液比、C為乙醇體積分數。各項系數的絕對值代表相應因素對黃酮提取量的影響程度,系數的正負代表影響方向。由表3數據可以看出,A、B、A2、B2對黃酮提取率影響極顯著,AC、C2對黃酮提取影響顯著。A、B、C三個因素中,對于毛果魚藤黃酮提取率的影響程度由大到小為B>A>C。擬合模型的修正相關系數平方(R2)為0.9790,即97.90%的數據可用此方程解釋;失擬項檢驗值>0.05,不顯著;用上述方程描述各因素與響應值的關系時,其變量和全體自變量之間的線性關系(R=7.77/7.94=0.9786),模型的顯著水平P<0.0001,回歸方差模型極顯著,表明該方程可靠且對實驗擬合良好,無其他因素的顯著影響,實驗誤差較小,可對不同條件下的總黃酮提取率進行分析和預測。2.2.2.料液比和提取時間的交互作用響應曲面圖中的響應值與各影響因素所構成的三維空間的曲面圖以及其在二維平面上的等高線圖,可較為直觀地反映出各因素及各因素的相互作用對黃酮提取率的影響。應用Design-Expert軟件中的Box-Behnken模型,將影響毛果魚藤總黃酮提取率的一個因素固定為零水平,得到另外兩個因素對提取率的交互影響結果,其對應的響應曲面及等高線,結果如圖6~8所示。圖6結果顯示,在料液比不變的條件下,隨著提取時間的增加,提取率先增加后降低,但是變化幅度不大。當料液比在低水平時,提取率的變化不大,而且提取率比較低;在高水平條件下,提取率變化較大。在提取時間不變的情況下,隨著料液比的逐漸增加,提取率呈現上升趨勢,且變化明顯。由響應曲面圖可以看出料液比與提取時間的交互作用比較顯著。圖7顯示,在提取時間不變的條件下,隨著乙醇體積分數的增加,提取率稍有增加,但是變化幅度不大,且均處于較高水平。在乙醇體積分數不變的情況下,隨著提取時間的增加,提取率呈現上升趨勢,且在25min左右出現峰值,隨后又降低。由響應曲面圖可以看出料液比與提取時間的交互作用比較顯著。圖8顯示,在料液比不變的前提下,隨著乙醇的體積分數的增加,黃酮的提取率增加不明顯。在乙醇的體積分數不變的前提下,隨著料液比的增加,黃酮的提取率呈遞增趨勢,且在料液比為1∶40~1∶45的范圍內,出現定點,表示在此范圍內提取率出現最大值。2.2.3總黃酮理論提取率測定結果在選取的各因素范圍內,根據回歸模型通過Design-Expert軟件分析結果,得出毛果魚藤總黃酮的最佳提取工藝條件為:提取時間為24.46min,料液比為1∶44.34,乙醇體積分數為88.18%,在此條件下總黃酮理論提取率為4.322mg/g。為了便于實際操作,選擇提取時間為25min,料液比1∶45,乙醇體積分數為90%,提取功率為500W條件下進行實驗驗證,提取率分別為4.297、4.334、4.323mg/g,平均提取率為4.318mg/g,表明毛果魚藤黃酮的提取率與預測值基本吻合,說明預測模型與實際情況擬合較好。2.3黃酮菌試驗的研究2.3.1總黃酮的提取稱取毛果魚藤20g,按照上述實驗得到的優化工藝條件進行毛果魚藤總黃酮的提取,過濾提取液,濃縮,得到總黃酮粗粉3.75g(相當于總黃酮85.48mg),取粗粉0.88g,用1mLDMSO溶解,制成總黃酮質量濃度為20.0mg/mL的溶液,備用。2.3.2抑菌圈的直徑測定用打孔器將定性濾紙打成直徑6mm的紙片,將紙片高壓滅菌,烘干,在無菌的條件下,用鑷子將滅菌后的紙片放入“2.3.1”項中制備好的黃酮溶液中浸泡;用涂布法將各供試菌液涂布接種在培養基上,再用鑷子將浸泡在黃酮溶液中紙片放入到培養基上,藥敏片做為陽性對照,DMSO浸潤的濾紙片作為陰性對照(-),然后將培養皿置于37℃的培養箱中培養24h,測量抑菌圈的直徑(Ф)。判斷標準:Φ>6mm,判為有抑菌作用;Ф≤6mm,判為無抑菌作用;-為無效,10mm>Ф>6mm為低度敏感(+);15mm>Ф>10mm中度敏感(++);Ф>15mm為高度敏感(+++);結果如表4所示,毛果魚藤總黃酮提取物質量濃度為20.0mg/mL時,對金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用,屬于高度敏感,但對大腸桿菌、變形桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、血溶性鏈球菌卻沒有抑菌作用。3box-behnken效應面法本研究以毛果魚藤總黃酮提取率為指標,通過單因素試驗就料液比、提取時間、乙醇體積分數、提取功率和提取次數對毛果魚藤總黃酮提取率的影響進行考察;在此基礎上,利用Design-Expert軟件結合Box-Behnken設計法設計響應曲面試驗,建立了數學模型,預測得到了最優的提取工藝參數,分別為:提取時間為24.46min,料液比為1∶44.34,乙醇體積分數為88.18%,在此條件下總黃酮理論提取率為4.322mg/g,并對實驗進行驗證,驗證試驗毛果魚藤總黃酮平均提取率為4.318mg/g,與理論值(4.322mg/g)接近,表明Box-Behnken效應面法應用于中藥提取工藝篩選具有可行性。此外通過對毛果魚藤總黃酮提取物進行體外抑菌作用研究,表明質量濃度為20.0mg/mL毛果魚藤總黃酮對金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用,但對變形桿菌、大腸桿菌、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌、白色念