第7章微生物的遺傳變異和育種遺傳：親代與子代相似變異：親代與子代、子代間不同個體不完全相同遺傳（inheritance）和變異（variation）是生命的最本質特性之一遺傳型：表型（表現型）：生物的全部遺傳因子及基因具有一定遺傳型的個體，在特定環境條件下通過生長發育所表現出來的形態等生物學特征的總和。表型是由遺傳型所決定，但也和環境有關。表型飾變：表型的差異只與環境有關特點：暫時性、不可遺傳性、表現為全部個體的行為橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳。遺傳型變異（基因變異、基因突變）：遺傳物質改變，導致表型改變特點：遺傳性、群體中極少數個體的行為（自發突變頻率通常為10-6-10-9）微生物是遺傳學研究中的明星：微生物細胞結構簡單，營養體一般為單倍體，方便建立純系。很多常見微生物都易于人工培養，快速、大量生長繁殖。對環境因素的作用敏感，易于獲得各類突變株，操作性強。第一節遺傳的物質基礎一、DNA作為遺傳物質二、RNA作為遺傳物質三、朊病毒的發現與思考一、DNA作為遺傳物質第一節遺傳的物質基礎Avery在四十年代以更精密的實驗設計重復了以上實驗分別用降解DNA、RNA、蛋白質的酶作用于有毒的S型菌細胞抽提物只有DNA被酶降解破壞的抽提物無轉化活性DNA是轉化所必需的轉化因子第一節遺傳的物質基礎（參見P195）T2噬菌體感染實驗（1952年）第一節遺傳的物質基礎（參見P195）二、RNA作為遺傳物質生化提取分別獲得含RNA的煙草花葉病毒蛋白質外殼（病毒1）和核酸（病毒2）抗血清處理，證明雜種病毒的蛋白質外殼來自病毒1，而非病毒2雜種病毒的后代的蛋白質外殼表現為病毒2，而非病毒1遺傳物質是核酸（RNA）而非蛋白質第一節遺傳的物質基礎三、朊病毒的發現與思考（參見P191和P195）亞病毒的一種：具有傳染性的蛋白質致病因子，迄今為止尚為發現該蛋白內含有核酸。其致病作用是由于動物體內正常的蛋白質PrPc改變折疊狀態為PrPsc所致，而這二種蛋白質的一級結構并沒有改變。人的庫魯病(kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt

Jakobdisease,CJD)等羊搔癢癥(scrapie)牛海綿狀腦病(spongiformencephalopathy)引起人與動物的致死性中樞神經系統疾病Prusiner(1982)提出羊搔癢病因子是一種蛋白質侵染顆粒（proteinaceousinfectiousparticle），并將之稱做Prion或Virino。

-------朊病毒1997年，StanleyB.Prusiner榮獲諾貝爾獎第一節遺傳的物質基礎三、朊病毒的發現與思考1）蛋白質是否可以作為遺傳物質？

prion是生命的一個特例？還是僅僅為表達調控的一種形式？2）蛋白質折疊與功能的關系，是否存在折疊密碼？DNA→RNA→肽鏈→蛋白質遺傳物質在微生物細胞內存在的部位和方式一、7個水平該部分內容自學二、原核生物的質粒原核生物的質粒質粒的概念：游離于原核生物基因組以外，具有獨立復制能力的小型共價閉合環狀的dsDNA分子，即cccDNA。質粒賦予細菌某些對其生存并非必不可少的特殊功能。如：產毒、抗藥、產特殊酶、降解有毒化合物等質粒的主要類型高拷貝數(highcopynumber)質粒（每個宿主細胞中可以有10-100個拷貝）

———————松弛型質粒(relaxedplasmid)高拷貝數(highcopynumber)質粒（每個宿主細胞中可以有10-100個拷貝）

———————松弛型質粒(relaxedplasmid)窄宿主范圍質粒(narrowhostrangeplasmid)（只能在一種特定的宿主細胞中復制）廣宿主范圍質粒(broadhostrangeplasmid)（可以在許多種細菌中復制）典型質粒簡介F質粒：大腸桿菌等部分細菌內存在，決定其性別并具有轉移能力的質粒。R質粒：表現為對抗生素等藥物的抗性。Col質粒：細菌素的概念在醫療中具有危害，但可用于微生物篩選和基因工程的標記部分細菌由質粒編碼的蛋白質產生的能抑制或殺死其他近源細菌的代謝產物。用于“殘害手足”Ti質粒：誘癌質粒，導致植物產生根癌，膨大等現象；用于植物基因工程。月季根癌Ri質粒：發根質粒，誘發大量稱為毛狀根的不定根。降解性質粒：僅在假單胞菌（Pseudomonas）中發現。具有降解復雜有毒化合物的能力。“超級菌”。隱秘質粒（crypticplasmid）隱秘質粒不顯示任何表型效應，它們的存在只有通過物理的方法，例如用凝膠電泳檢測細胞抽提液等方法才能發現。它們存在的生物學意義，目前幾乎不了解。在應用上，很多隱秘質粒被加以改造作為基因工程的載體（一般加上抗性基因）第二節基因突變和誘變育種基因突變突變類型突變率基因突變的特點基因突變自發性和不對應性的實驗證明基因突變及機制紫外線對DNA的損傷及其修復基因突變（genemutation）基因突變的概念：泛指遺傳物質的分子結構或數量突然發生的可遺傳的變化，可自發或誘導產生。野生型菌株（wildtypestrain）：從自然界分離到的菌株。突變株（mutant）：野生型經突變后形成的帶有新性狀的菌株。基因突變的類型突變株的表型選擇性突變株（selectablemutant）非選擇性突變株（non－selectablemutant）營養缺陷型抗性突變型條件致死突變型形態突變型抗原突變型產量突變型突變率（mutationrate）細胞在每一世代中發生某一性狀突變的幾率。某一基因的突變一般是獨立發生的，他的突變率不影響其他基因的突變。通常突變發生的幾率為10-6～10-9

基因突變的特點1.自發性。2.不對應性細胞可自發的產生突變突變性狀與引起突變的原因間無直接對應關系3.稀有性突變幾率為10-6～10-9

4.獨立性5.可誘變性誘變劑的使用可大大提高突變幾率6.穩定性7.可逆性正向突變/回復突變基因突變自發性和不對應性的證明1.Luria等的變量實驗（fluctuationtest）2.Newcomb的涂布實驗3.Lederberg等的影印平板法（replicaplating）變量實驗（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943）SalvadorLuriaMaxDelbruckTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969Newcombe的涂布實驗（1949）影印實驗（replicaplating）JoshuaLederbergandEstherLederberg（1952）JoshuaLederbergJ.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958突變真的與選擇壓力無關嗎？適應性突變（adaptivemutability）和高頻突變（hypermutation

）BensonS.Adaptivemutation:ageneralphenomenonorspecialcase?Bioessays.1997Jan;19(1):9-11.Review.GalitskiT,RothJR.

Asearchforageneralphenomenonofadaptivemutability.Genetics.1996Jun;143(2):645-59.DanI.Andersson,E.SusanSlechta,andJohnR.RothEvidenceThatGeneAmplificationUnderliesAdaptiveMutabilityoftheBacteriallac

Operon。Science1998November6;282:1133-1135.

GodoyVG,FoxMS.

Transposonstabilityandaroleforconjugationaltransferinadaptivemutability.ProcNatl

Acad

SciUSA.2000Jun20;97(13):7393-8.BullHJ,McKenzieGJ,HastingsPJ,RosenbergSM.Evidencethatstationary-phasehypermutationintheEscherichiacolichromosomeispromotedbyrecombination.Genetics.2000Apr;154(4):1427-37.基因突變及其機制基因突變誘變堿基置換移碼突變點突變畸變缺失添加易位、倒位自發突變紫外線對DNA的損傷及其修復UV導致遺傳物質產生嘧啶二聚體（TT、TC、CC），造成局部DNA分子無法配對，引起微生物的死亡或突變。一般微生物具有光復活作用。在利用UV進行誘變育種等工作時，應在紅光燈下進行照射和后繼操作，并放置在黑暗條件下培養。突變與育種一、自發突變與育種（breedingbyspontaneousmutation）1.從生產中育種。仔細觀察，做“伯樂”2.定向培育優良菌株。卡介苗（BCGvaccine）：BacillusCalmette-GuerinA.CalmetteC.Guerin誘變育種

（breedingbyinducedmutation）誘變育種是指利用物理、化學等誘變劑處理均勻而分散的微生物細胞群，在促進其突變率顯著提高的基礎上，采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數符合目的的突變株，以供科學試驗和生產實踐使用。誘變育種的幾個原則1.選擇簡便有效的誘變劑誘變劑物理誘變劑：化學誘變劑：紫外線、激光、離子束、r－Ray烷化劑、堿基類似物等很多種化學物質，能以各種機制導致DNA的突變a）利用各種誘變劑獲得各類遺傳突變，進行誘變育種；b）對有害微生物進行控制；c）危害人類自身的健康“生物化學統一性”法則：人和細菌在DNA的結構及特性方面是一致的，能使微生物發生突變的誘變劑必然也會作用于人的DNA，使其發生突變，最后造成癌變或其他不良的后果。誘變劑的共性原則：化學藥劑對細菌的誘變率與其對動物的致癌性成正比

超過95%的致癌物質對微生物有誘變作用90%以上的非致癌物質對微生物沒有誘變作用回復突變(reversemutation或backmutation)：突變體失去的野生型性狀，可以通過第二次突變得到恢復，這種第二次突變稱為回復突變美國加利福尼亞大學的BruceAmes教授于1966年發明，因此稱為Ames試驗具體操作：檢測鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphmurium)組氨酸營養缺陷型菌株(his-)的回復突變率Ames試驗證明Ames試驗重要性的應用實例：國外曾開發了一種降低婦女妊娠反應的藥物“反應停”，由于其藥效顯著，在60-70年代十分流行，但隨后人們就發現畸形兒的出生率明顯增高，而且生產畸形兒的婦女大多曾服用“反應停”，后來采用Ames試驗發現這種物質的確具有很強的致突變作用，因此這種藥物被禁止使用但如果能在這種藥物上市之前就進行Ames試驗檢測，那么這種大量出生畸形兒的悲劇完全可以避免，第四節基因突變及修復三、誘變劑與致癌物質——Ames試驗（參見P212）由于生物體內、體外可能存在的差異，可在體外加入哺乳動物（如大鼠）微粒體酶系統，使待測物活化，使Ames試驗的準確率達80-90%。誘變育種的幾個基本原則2.挑選優良的出發菌株依靠經驗誘變育種的幾個基本原則3.處理單細胞或單孢子懸液誘變育種的細胞應盡量選用單核細胞，絲狀菌應選用單孢子。誘變育種的幾個基本原則4.選用最適的誘變劑量劑量存活率曲線，劑量右誘變率曲線。誘變育種的幾個基本原則5.充分利用復合處理的協同效應誘變育種的幾個基本原則6.利用和創造形態、生理與產量間的相關指標利用蛋白酶水解圈、淀粉酶變色圈、纖維素水解圈等誘變育種的幾個基本原則7.設計高效篩選方案8.創造新型篩選方法結合具體的目標，大膽嘗試，勇于創新。3類突變株的篩選方法1.產量突變株的篩選2.抗藥性突變株的篩選梯度平板法定向培育若干代謝產物高產菌株3.營養缺陷型突變株的篩選基本培養基：MMM9medium：Na2HPO412.8gKH2PO43.0gNaCl0.5gNH4Cl0.5g葡萄糖(單獨滅菌)10.0g維生素B1(單獨滅菌)1μg/ml

pH自然

不能錯誤的認為基本培養基均是簡單的，不含生長因子的。完全培養基：CMPepton(蛋白胨)5gBeefextract(牛肉膏)30g

NaCl5gAgar(瓊脂)15g

Distilledwater(蒸餾水)Adjust(調)pHto7.0-7.2

可滿足一切營養缺陷型菌株營養需要的天然或半組合培養基。補充培養基：CM例如：在M9培養基中添加L－His等只能滿足相應的營養缺陷型突變株生長需要的組合或半組合培養基。3類遺傳個體：野生型：MM、CM、SM均能生長營養缺陷型：CM、SM能生長原養型：MM、CM、SM均能生長營養缺陷型的表示方法：基因型：所需營養物的前三個英文小寫斜體字母表示：hisC（組氨酸缺陷型，其中的大寫字母C同一表型中不同基因的突變）表型：同上，但第一個字母大寫，且不用斜體：HisC在具體使用時多用hisC-和hisC+，分別表示缺陷型和野生型。第三節基因重組和雜交育種一、原核生物的基因重組轉化轉導接合原生質體融合接合(conjugation)：細胞與細胞的直接接觸（由F因子介導）轉導(transduction)：由噬菌體介導自然遺傳轉化(naturalgenetictransformation)：游離DNA分子+感受態細胞一、細菌的接合作用(conjugation)通過細胞與細胞的直接接觸而產生的遺傳信息的轉移和重組過程1.實驗證據

1946年，JoshuaLederberg

和EdwardL.Taturm細菌的多重營養缺陷型雜交實驗（參見P215）中間平板上長出的原養型菌落是兩菌株之間發生了遺傳交換和重組所致！參見P216證實接合過程需要細胞間的直接接觸的“U”型管實驗（BernardDavis，1950

）參見P2162.機制(大腸桿菌的接合機制)接合作用是由一種被稱為F因子的質粒介導F因子的分子量通常為5×107，上面有編碼細菌產生性菌毛（sexpili）及控制接合過程進行的20多個基因。含有F因子的細胞：“雄性”菌株（F+），其細胞表面有性菌毛

不含F因子的細胞：“雌性”菌株（F-），細胞表面沒有性菌毛參見P217F因子為附加體質粒既可以脫離染色體在細胞內獨立存在，也可插入（整合）到染色體上F因子的四種細胞形式(參見P202)a）F-菌株，不含F因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收

F因子而變成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F因子獨立存在，細胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F因子插入到染色體DNA上，細胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株內的F因子因不正常切割而脫離染色體時，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。細胞表面同樣有性菌毛。1）F+×F-雜交雜交的結果：給體細胞和受體細胞均成為F+細胞理化因子的處理可將F因子消除而使F+菌株變成F-菌株F+菌株的F因子向F-細胞轉移，但含F因子的宿主細胞的染色體DNA一般不被轉移。（參見P215）Hfr菌株的F因子插入到染色體DNA上，因此只要發生接合轉移轉移過程，就可以把部分甚至全部細菌染色體傳遞給F-細胞并發生重組，由此而得名為高頻重組菌株。2）Hfr

×F-雜交（參見P217）Hfr菌株仍然保持著F+細胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一樣與F-細胞進行接合。所不同的是，當OriT序列被缺刻螺旋酶識別而產生缺口后，F因子的先導區(leadingregion)結合著染色體DNA向受體細胞轉移，F因子除先導區以外，其余絕大部分是處于轉移染色體的末端，由于轉移過程常被中斷，因此F因子不易轉入受體細胞中，故Hfr×F-雜交后的受體細胞(或接合子)大多數仍然是F-。染色體上越靠近F因子的先導區的基因，進入的機會就越多，在F-中出現重組子的的時間就越早，頻率也高。F因子不易轉入受體細胞中，故Hfr×F-雜交后的受體細胞（或稱接合子）大多數仍然是F-。（參見P218）3）F′×F-雜交Hfr菌株內的F因子因不正常切割而脫離染色體時，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。（參見P218）F′×F-與F+×F-的不同：給體的部分染色體基因隨F′一起轉入受體細胞a）與染色體發生重組；b）繼續存在于F′因子上，形成一種部分二倍體；細胞基因的這種轉移過程又常稱為性導（sexduction）、F因子轉導（F-duction），或F因子媒介的轉導（F-mediatedtransduction）。Lederbergcoinedthetermplasmidinthe1950stodescribesuchapparentlyextrachromosomalgeneticelements,althoughitdidnotfindwideusageuntilthe1970swheninfectiousdrugresistancebecomeamedicalproblem.二、細菌的轉導（transduction）由噬菌體介導的細菌細胞間進行遺傳交換的一種方式：一個細胞的DNA通過病毒載體的感染轉移到另一個細胞中能將一個細菌宿主的部分染色體或質粒DNA帶到另一個細菌的噬菌體稱為轉導噬菌體細菌轉導的二種類型：普遍性轉導局限性轉導（參見P218）1、普遍性轉導（generalizedtransduction）噬菌體可以轉導給體染色體的任何部分到受體細胞中的轉導過程(1)意外的發現1951年，JoshuaLederberg和NortonZinder為了證實大腸桿菌以外的其它菌種是否也存在接合作用，用二株具不同的多重營養缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌進行類似的實驗：用“U”型管進行同樣的實驗時，在給體和受體細胞不接觸的情況下，同樣出現原養型細菌！（參見P218）沙門氏菌LT22A是攜帶P22噬菌體的溶源性細菌另一株是非溶源性細菌一個表面看起來的常規研究卻導致一個驚奇和十分重要發現的重要例證！基因的傳遞很可能是由可透過“U”型管濾板的P22噬菌體介導的（普遍性轉導這一重要的基因轉移途徑的發現）（參見P218）(2)轉導模型（參見P219）（參見P219）轉導噬菌體為什么“錯”將宿主的DNA包裹進去?噬菌體的DNA包裝酶酶也能識別染色體DNA上類似pac的位點并進行切割，以“headful”的包裝機制包裝進P22噬菌體外殼，形成只含宿主DNA的轉導噬菌體顆粒（假噬菌體）。因為染色體上的pac與P22DNA的pac序列不完全相同，利用效率較低，這種“錯裝”機率一般僅約10-6-10-8形成轉導顆粒的噬菌體可以是溫和的也可以是烈性的，但必須具有能偶爾識別宿主DNA的包裝機制并在宿主基因組完全降解以前進行包裝。普遍性轉導的基本要求：（參見P219）普遍性轉導的三種后果：進入受體的外源DNA通過與細胞染色體的重組交換而形成穩定的轉導子流產轉導（abortivetransduction）轉導DNA不能進行重組和復制，但其攜帶的基因可經過轉錄而得到表達。特點：在選擇培養基平板上形成微小菌落外源DNA被降解，轉導失敗。DNA不能復制，因此群體中僅一個細胞含有DNA，而其它細胞只能得到其基因產物，形成微小菌落。2、局限性轉導（specializedtransduction）（參見P219）溫和噬菌體感染整合到細菌染色體的特定位點上宿主細胞發生溶源化溶源菌因誘導而發生裂解時，在前噬菌體二側的少數宿主基因因偶爾發生的不正常切割而連在噬菌體DNA上部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數特定基因轉移到受體菌中2、局限性轉導（specializedtransduction）溫和噬菌體λ裂解時的不正常切割：包含gal或bio基因（幾率一般僅有10-6）缺陷噬菌體在宿主細胞內能夠象正常的λDNA分子一樣進行復制、包裝，提供所需要的裂解功能，形成轉導顆粒。但沒有正常噬菌體的溶源性和增殖能力，感染受體細胞后，通過DNA整合進宿主染色體而形成穩定的轉導子。局限性轉導與普遍性轉導的主要區別：a）被轉導的基因共價地與噬菌體DNA連接，與噬菌體DNA一起進行復制、包裝以及被導入受體細胞中。而普遍性轉導包裝的可能全部是宿主菌的基因。b）局限性轉導顆粒攜帶特定的染色體片段并將固定的個別基因導入受體，故稱為局限性轉導。而普遍性轉導攜帶的宿主基因具有隨機性。2、局限性轉導（specializedtransduction）（參見P219）

溶源轉變（lysogenicconversion）：一個與轉導相似又不同的現象溫和噬菌體感染細胞后使之發生溶源化，因噬菌體的基因整合到宿主染色體上，而使后者獲得了新性狀的現象。溶源轉變與轉導的不同？a）不攜帶任何供體菌的基因；b）這種噬菌體是完整的，而不是缺陷的；三、細菌的遺傳轉化（genetictransformation）定義：同源或異源的游離DNA分子(質粒和染色體DNA)被自然或人工感受態細胞攝取，并得到表達的水平方向的基因轉移過程自然遺傳轉化（naturalgenetictransformation）人工轉化（artificialtransformation）感受態細胞：具有攝取外源DNA能力的細胞（competentcell）自然感受態與人工感受態的不同？自然感受態的出現是細胞一定生長階段的生理特性，受細菌自身的基因控制；人工感受態則是通過人為誘導的方法，使細胞具有攝取DNA的能力，或人為地將DNA導入細胞內。

（該過程與細菌自身的遺傳控制無關！）1、自然遺傳轉化（簡稱自然轉化）1928年，Griffith發現肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）

的轉化現象目前已知有二十多個種的細菌具有自然轉化的能力進行自然轉化，需要二方面必要的條件：建立了感受態的受體細胞外源游離DNA分子枯草芽孢桿菌的自然轉化過程（革蘭氏陽性菌的轉化模型）見P222自然轉化過程的特點：a）對核酸酶敏感；c）轉化是否成功及轉化效率的高低主要取決于轉化（DNA）

給體菌株和轉化受體菌株之間的親源關系；d）通常情況下質粒的自然轉化效率要低得多；提高質粒的自然轉化效率的二種方法：1）使質粒形成多聚體，這樣進入細胞后重新組合成有活性的質粒的幾率大大提高；2）在質粒上插入受體菌染色體的部分片段，或將質粒轉化進含有與該質粒具有同源區段的質粒的受體菌-------重組獲救b）不需要活的DNA給體細胞；噬菌體DNA被感受態細胞攝取并產生有活性的病毒顆粒轉染(transfection)：現在把DNA轉移至動物細胞的過程也稱轉染提純的噬菌體DNA以轉化的（而非感染）途徑進入細胞并表達后產生完整的病毒顆粒。特點：自然遺傳轉化的進行涉及到細菌染色體上幾十個基因的功能及彼此間的相互協調，因此被認為是名副其實的細菌水平基因轉移途徑。目前的研究熱點：1）細菌為什么要耗費如此多的染色體遺傳資源來進行自然轉化，即該過程的生物學意義到底何在？它對細菌自身有什么好處？（人們已提出了一些假說，但均不圓滿）2）自然轉化過程的很多細節仍不清楚，包括細菌如何協調感受態

的建立，外源DNA進入和重組的具體過程等等3）細菌中具有自然轉化能力的范圍，到底有那些菌具有自然轉化能力？4）轉化DNA的來源和在自然環境中發生的自然轉化接合(conjugation)：細胞與細胞的直接接觸（由F因子介導）轉導(transduction)：由噬菌體介導自然遺傳轉化(