專題1《基因工程》復習基因工程基本工具操作程序限制性核酸內切酶DNA連接酶運載體分類及區別作用常用載體：質粒：特點載體條件其他載體目的基因的獲取從基因文庫中獲取人工合成利用PCR技術擴增基因組文庫cDNA文庫原理條件過程基因表達載體的構建目的組成及作用目的基因導入受體細胞植物細胞動物細胞微生物細胞主要：農桿菌轉化法顯微注射技術Ca2+處理目的基因的檢測與鑒定分子水平的檢測個體生物水平的鑒定應用轉基因植物轉基因動物基因工程藥物基因治療抗蟲轉基因植物抗病轉基因植物抗逆轉基因植物改良植物品質提高動物生長速度改善畜產品質量生產藥物做器官移植供體基因診斷蛋白質工程概念原理應用來源特點識別核苷酸序列結果II

II

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I標記基因、目的基因、T-DNA、Ti-質粒、啟動子、終止子、限制酶、DNA連接酶、逆轉錄酶、基因文庫、基因組文庫、cDNA文庫、PCR技術、熱穩定DNA聚合酶、引物、轉化、農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射技術、感受態細胞、DNA分子雜交技術、（基因）探針、雜交帶、抗原-抗體雜交基因工程技術的專有技術名詞復習的主要內容1、基因工程的工具2、基因工程的基本程序三、基因操作的工具

基因的剪刀（分子手術刀）——限制性核酸內切酶（限制酶）

基因的針線（分子縫合針）——DNA連接酶

基因的運輸工具（分子運輸車）——運載體

名稱作用參與的生理過程DNA連接酶限制酶DNA聚合酶RNA聚合酶解旋酶逆轉錄酶連接兩個DNA片段，是通過磷酸二酯鍵連接雙鏈DNA的缺口基因工程識別某種特定的脫氧核苷酸序列，并在特定的切點切割基因工程DNA復制、PCR技術在脫氧核苷酸鏈上添加單個脫氧核苷酸轉錄DNA復制及轉錄使堿基間氫鍵斷裂形成單脫氧核苷酸鏈注意：使DNA解成兩條長鏈的方法除用解旋酶以外，在適當的高溫（如94℃）可使DNA解旋。逆轉錄，基因工程以RNA為模板合成DNA在核糖核苷酸鏈上添加單個核糖核苷酸1、限制酶

①分布：主要在原核生物中。②作用特點:專一性，識別特定核苷酸序列，切割特定切點。

③識別的核苷酸序列：④結果：產生黏性未端和平末端

舉例：EcoR1限制酶、Sma1限制酶

▲“黏性末端”和“平末端”當限制酶在它識別序列的中心軸線的兩側將DNA的兩條鏈分別切開時，產生的是黏性末端.而當限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時，產生的則是平末端。1.要想獲得某一個特定性狀的基因(即”目的基因”)必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性末端？要切兩個切口，產生四個黏性末端2.如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，產生黏性末端相同嗎？會產生相同的黏性末端思考:2、DNA連接酶

①連接的部位：磷酸和脫氧核糖之間的鍵：磷酸二酯鍵（梯子的扶手）③分類：E·coliDNA連接酶

T4DNA連接酶

二者在性質上的區別來源功能同異名稱E.ColiDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體形成磷酸二酯鍵只能:互補的黏性末端黏性末端和平末端均可E·coliDNA連接酶與T4DNA連接酶的比較

3、運載體

①作用：將外源基因送入受體細胞。

②具備的條件：能在宿主細胞內復制，并穩定地保存。

具有多個限制酶切點。

具有某些標記基因

③舉例：質粒、噬菌體和動植物病毒。

質粒（1）獲取目的基因有什么方法？（2）如何從基因文庫中獲取目的基因？（3）簡述利用PCR技術擴增目的基因的前提和過程。（4）基因工程的核心是什么？（5）一個基因表達載體包括哪些部分？分別有什么作用？（6）簡述目的基因與運載體結合的過程。（7）基因工程常有的受體細胞有哪些？（8）將目的基因導入植物細胞有哪些方法？采用最多的方法是什么？試簡述該方法的操作過程。（9）將目的基因導入大腸桿菌最常用的轉化方法是什么？（10）簡述目的基因的分子檢測的步驟和方法。四、基因工程的基本操作程序四、基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構建3、將目的基因導入受體細胞4、目的基因的檢測與鑒定步驟一獲得目的基因1、人工合成2、從基因文庫中獲取3、利用PCR技術擴增(基因比較小，序列已知)基因文庫基因組文庫部分基因文庫－－如：cDNA文庫聚合酶鏈式反應(已知一段目的基因核苷酸序列)基因組文庫的構建模式圖通過對受體菌的培養而儲存基因cDNA合成過程

第一步，反轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。如何從基因文庫中獲取目的基因？利用PCR技術擴增目的基因原理:DNA雙鏈復制前提:要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成引物。氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。在酶的作用下，不斷延伸，合成雙鏈DNA。多次循環，獲得大量雙鏈DNA分子。PCR技術擴增細胞內復制.VS.PCR擴增DNA母鏈4種dNTPTaqDNA聚合酶引物（2個）溫度控制1）模板：2）原料：3）酶：4）能量DNA母鏈4種dNTP解旋酶DNA聚合酶DNA增殖5）特點:半保留復制邊解旋邊復制(不用DNA連接酶)半保留復制全解旋再復制能量?1個DNA分子進行PCR擴增,循環4次，理論上至少需要幾個引物？表達載體需由哪幾部分組成復制原點啟動子目的基因終止子標記基因它們的作用是？第二步：基因表達